Virologie Evelien Floor
HC8-10 binnendringen van virussen
Er zijn drie stadia in het binnendringen van een gastheercel door virussen:
1. Aanhechting
2. Penetratie
3. Ontmanteling
Aanhechting
Aanhechting aan een gastheercel wordt gemedieerd door cellulaire receptoren. Deze zijn essentieel
voor alle virussen behalve voor gist en schimmel virussen (geen extracellulair stadium) en planten
virussen (dringen cellen binnen via mechanische schade). Er bevinden zich verschillende typen virus
receptoren op het plasmamembraan: eiwitten en suikers.
Functies van receptoren zijn:
• Binding van virus aan een cel
• Induceren van conformatie veranderingen die leiden tot membraanfusie of penetratie van de
membraan
• Interactie met andere receptoren
• Targetten van virus naar lage pH compartimenten
Affiniteit en aviditeit
Affiniteit is de sterkte van de interactie van een enkele
receptor met een enkel viraal receptor bindend eiwit:
een op een interactie. Aviditeit is de sterkte van de
overall interactie van meerdere receptoren met
meerdere receptor bindende eiwitten. Aviditeit is meer
dan enkel de som van de individuele affiniteiten.
Aviditeit wordt uitgedrukt als de bindingsconstante
(Keq). De aviditeit kan gigantisch oplopen. De interactie van een receptor en een virale ligand is over
het algemeen een lage affiniteit interactie. De combinatie van meerdere receptoren met virale
liganden leidt tot een hoge aviditeit interactie.
Identificatie van virale receptoren
Monoklonale antilichamen
Virus interactie studies konden gedaan worden door de
introductie van monoclonale antilichamen. In een muis
worden oppervlakte antigenen (receptor) ingebracht.
Hierdoor gaan plasmacellen zich ontwikkelen welke
monoclonale antilichamen gaan produceren tegen dit
antigen. Vervolgens worden de plasmacellen gefuseerd
met tumorcellen en worden hybridomas gevormd. Deze
produceren continue de specifieke monoklonale
antilichamen welke vervolgens worden gebruikt in een
neutralisatie assay: welk antilichaam blokkeert het
binnendringen van een virus in de gastheercel.
DNA cloning en transformatie
Een andere methode voor het identificeren van virale receptoren is via DNA cloning en transformatie.
Receptor genen worden geïsoleerd uit susceptibele cellen en gekloneerd tot cDNA. Vervolgens wordt
het cDNA getransformeerd in niet-susceptibele cellen, sommige van deze cellen zullen nu het receptor
cDNA tot expressie gaan brengen. Er zijn dan verschillende methoden om de cellen te selecteren die
de virale receptor tot exrpessie brengen.
1
, Virologie Evelien Floor
Een eerste selectie methode is de cellen infecteren met
een recombinant virus die een drug resistentie gen bevat.
Na infectie kan dan selectie plaatsvinden voor cellen die
de receptor tot expressie brengen door de drug toe te
voegen. Een tweede selectie methode is de cellen
infecteren met een recombinant virus die een marker gen
bevat. Na infectie kan dan selectie plaatsvinden door
detectie van het marker gen. Tot slot kan selectie
plaatsvinden door gebruik te maken van receptor
bindende antilichamen met een fluorescente tag.
CRISPR/cas
Tegenwoordig wordt CRISPR/Cas ook veel gebruikt om
receptoren te identificeren. Er wordt dan een library
gemaakt met onder andere gemuteerde receptor genen.
Vervolgens worden de cellen geïnfecteerd met virussen.
Overlevende cellen kunnen gesequenced worden om het
gen coderend voor de receptor te identificeren.
Receptoren
Er is weinig overeenkomst tussen de verschillende receptoren die door virussen gebruikt worden. Zelfs
binnen virussen van dezelfde familie worden verschillende receptoren gebruikt. Virussen zijn in staat
meerdere receptoren te binden tijdens entry maar ook tijdens verschillende stadia. Daarnaast maken
sommige virussen gebruik van receptoren die op het endosomale membraan aanwezig zijn. Het ebola
virus bijvoorbeeld bevat een mucin en glycan cap en wordt eerst geïnternaliseerd. In het endosoom
wordt deze cap verwijderd waardoor de glycoproteïnen aan de endosomale receptor kunnen binden.
Vervolgens vindt fusie met de endosoom plaats en komt het genetisch materiaal vrij.
Virus-receptor interacties
Naakte virussen binden aan receptoren via het capside oppervlak of uitsteeksels. Voorbeelden hiervan
zijn poliovirus, adenovirus en polyomavirus. Envelop virussen binden aan receptoren via
transmembraan glycoproteïnen. Voorbeelden hiervan zijn influenzavirus, SARS coronavirus, HIV-1,
ebolavirus en herpes simplex virus.
Poliovirus
Poliovirus gebruikt Pvr (CD155) om aan de gastheercel te hechten. Het capside eiwit VP1 gaat
interactie aan met de receptor, hiervan zijn er 60 aanwezig op het virion.
Rhinovirus
Rhinovirus gaat interactie aan met ICAM-1 op de gastheercel ook via VP1.
2
HC8-10 binnendringen van virussen
Er zijn drie stadia in het binnendringen van een gastheercel door virussen:
1. Aanhechting
2. Penetratie
3. Ontmanteling
Aanhechting
Aanhechting aan een gastheercel wordt gemedieerd door cellulaire receptoren. Deze zijn essentieel
voor alle virussen behalve voor gist en schimmel virussen (geen extracellulair stadium) en planten
virussen (dringen cellen binnen via mechanische schade). Er bevinden zich verschillende typen virus
receptoren op het plasmamembraan: eiwitten en suikers.
Functies van receptoren zijn:
• Binding van virus aan een cel
• Induceren van conformatie veranderingen die leiden tot membraanfusie of penetratie van de
membraan
• Interactie met andere receptoren
• Targetten van virus naar lage pH compartimenten
Affiniteit en aviditeit
Affiniteit is de sterkte van de interactie van een enkele
receptor met een enkel viraal receptor bindend eiwit:
een op een interactie. Aviditeit is de sterkte van de
overall interactie van meerdere receptoren met
meerdere receptor bindende eiwitten. Aviditeit is meer
dan enkel de som van de individuele affiniteiten.
Aviditeit wordt uitgedrukt als de bindingsconstante
(Keq). De aviditeit kan gigantisch oplopen. De interactie van een receptor en een virale ligand is over
het algemeen een lage affiniteit interactie. De combinatie van meerdere receptoren met virale
liganden leidt tot een hoge aviditeit interactie.
Identificatie van virale receptoren
Monoklonale antilichamen
Virus interactie studies konden gedaan worden door de
introductie van monoclonale antilichamen. In een muis
worden oppervlakte antigenen (receptor) ingebracht.
Hierdoor gaan plasmacellen zich ontwikkelen welke
monoclonale antilichamen gaan produceren tegen dit
antigen. Vervolgens worden de plasmacellen gefuseerd
met tumorcellen en worden hybridomas gevormd. Deze
produceren continue de specifieke monoklonale
antilichamen welke vervolgens worden gebruikt in een
neutralisatie assay: welk antilichaam blokkeert het
binnendringen van een virus in de gastheercel.
DNA cloning en transformatie
Een andere methode voor het identificeren van virale receptoren is via DNA cloning en transformatie.
Receptor genen worden geïsoleerd uit susceptibele cellen en gekloneerd tot cDNA. Vervolgens wordt
het cDNA getransformeerd in niet-susceptibele cellen, sommige van deze cellen zullen nu het receptor
cDNA tot expressie gaan brengen. Er zijn dan verschillende methoden om de cellen te selecteren die
de virale receptor tot exrpessie brengen.
1
, Virologie Evelien Floor
Een eerste selectie methode is de cellen infecteren met
een recombinant virus die een drug resistentie gen bevat.
Na infectie kan dan selectie plaatsvinden voor cellen die
de receptor tot expressie brengen door de drug toe te
voegen. Een tweede selectie methode is de cellen
infecteren met een recombinant virus die een marker gen
bevat. Na infectie kan dan selectie plaatsvinden door
detectie van het marker gen. Tot slot kan selectie
plaatsvinden door gebruik te maken van receptor
bindende antilichamen met een fluorescente tag.
CRISPR/cas
Tegenwoordig wordt CRISPR/Cas ook veel gebruikt om
receptoren te identificeren. Er wordt dan een library
gemaakt met onder andere gemuteerde receptor genen.
Vervolgens worden de cellen geïnfecteerd met virussen.
Overlevende cellen kunnen gesequenced worden om het
gen coderend voor de receptor te identificeren.
Receptoren
Er is weinig overeenkomst tussen de verschillende receptoren die door virussen gebruikt worden. Zelfs
binnen virussen van dezelfde familie worden verschillende receptoren gebruikt. Virussen zijn in staat
meerdere receptoren te binden tijdens entry maar ook tijdens verschillende stadia. Daarnaast maken
sommige virussen gebruik van receptoren die op het endosomale membraan aanwezig zijn. Het ebola
virus bijvoorbeeld bevat een mucin en glycan cap en wordt eerst geïnternaliseerd. In het endosoom
wordt deze cap verwijderd waardoor de glycoproteïnen aan de endosomale receptor kunnen binden.
Vervolgens vindt fusie met de endosoom plaats en komt het genetisch materiaal vrij.
Virus-receptor interacties
Naakte virussen binden aan receptoren via het capside oppervlak of uitsteeksels. Voorbeelden hiervan
zijn poliovirus, adenovirus en polyomavirus. Envelop virussen binden aan receptoren via
transmembraan glycoproteïnen. Voorbeelden hiervan zijn influenzavirus, SARS coronavirus, HIV-1,
ebolavirus en herpes simplex virus.
Poliovirus
Poliovirus gebruikt Pvr (CD155) om aan de gastheercel te hechten. Het capside eiwit VP1 gaat
interactie aan met de receptor, hiervan zijn er 60 aanwezig op het virion.
Rhinovirus
Rhinovirus gaat interactie aan met ICAM-1 op de gastheercel ook via VP1.
2
