HC9 – Chapter 12, Intracellular Compartments and Protein Sorting
Het grootste verschil tussen een prokaryotische en eukaryotische cel is de compartimentalisatie bij
eukaryoten. De celkern en mitochondriën hebben een dubbel membraan, de plasmamembraan en ER
hebben een enkel membraan. Liquid-liquid phase separation is een vorm van compartimentalisatie, maar
zonder membranen.
Cytoplasma = vloeistof met organellen. Cytosol = vloeistof zonder organellen.
Organellen als de kern, mitochondriën en chloroplasten ontstaan niet de novo, maar worden
verdeeld bij deling en groeien vervolgens. Het vesiculair transport ontstaat wel de novo (dus
ook het Golgi). Peroxisomen zijn een uitzondering die zowel niet als wel de novo ontstaan.
Typen transport
1. Moleculaire/gated transport (HC8)
o Diffusie in het membraan
o Diffusie in het cytosol
o Diffusie tussen cytosol en kern
2. Eiwit translocatie (HC8) over een membraan
o Een membraan is hydrofoob, er zijn dus kanalen nodig om hydrofiele
eiwitten er door te laten
3. Vesiculair transport (HC9), afsnoering en fuseren van blaasjes ➔ secretie pathway
o Passief: diffusie
o Actief: cytoskelet
Eiwitten worden specifiek getarget naar een organel via signaalsequenties. Signaal voor
import naar peroxisomen is bv de SKL sequentie (Ser, Lys, Leu) en signaal voor terugkeer naar het ER is de
KDEL sequentie (Lys, Asp, Glu, Leu).
Nucleaire porie complex (NPC)
Eiwitten kunnen zonder te ontvouwen de lipide dubbelmembraan passeren de kern in. De voornamelijke
cargo van de kern naar het cytosol naast mRNA zijn de ribosomen. Die zijn erg groot, wat betekent dat de
nucleaire poriën in de kernmembraan dynamisch en reguleerbaar moeten zijn. De bi-directionele (zowel
import als export) transport snelheid is 1000 moleculen per seconde. De poriën zijn watergevulde kanalen
en bestaan uit veel onderdelen = nucleaire porie complex (NPC). De scaffold en channel nucleoporines
zorgen voor het buigen van het nucleaire dubbelmembraan. De poriën zitten ook in het ER.
Page 1 of 62
,Een NPC bestaat uit 30 verschillende subunits bestaande uit 1000 eiwitten. De celkern heeft 3000-4000 van
dit soort NPCs.
• Kleine moleculen <5 kDa kunnen vrij door de NPC diffunderen
• Eiwitten <60 kDa kunnen er passief doorheen diffunderen, maar gaat langzaam
• Eiwitten >60 kDa moeten actief worden geïmporteerd/geëxporteerd
De signaal sequentie om moleculen de kern in te transporteren is de nuclear localization signal (NLS). De
kern uit exporteren kan met de nuclear export signal (NES).
De NLS is meestal een positieve sequentie en kan zich overal in het eiwit bevinden, maar de oppervlakte
moet wel blootgesteld zijn om te werken.
Als er in de signaal sequentie één mutatie zit, gaat het eiwit al niet meer naar de kern. Dit kan bekeken
worden onder de EM door eiwitten te binden aan goud en daarna de cel te fixeren.
De positieve signaal sequentie bindt aan een nucleair import receptor. Er zijn verschillende import
receptoren om verschillende eiwitten te transporteren. De signaal sequentie kan direct of indirect (via een
nucleair import adapter eiwit) binden aan de import receptor/importine.
Zodra een importine bindt aan NLS van het eiwit kan het vervolgens ook binden aan de FG repeats van
NPC. Deze repeats bevinden zich in de fibrillen. De interactie is van lage affiniteit. Door te bewegen, binden
en los te laten leiden ze het eiwit-receptor complex naar binnen. Het importproces is dus ook
concentratieafhankelijk.
Nucleair transport
Bi-directioneel transport wordt gereguleerd door een diffusiegradiënt van actief en inactief Ran m.b.v.
GTP. In het cytosol wordt het gradiënt Ran-GDP hoog gehouden door aanwezigheid van Ran-GAP (GTPase
Activating Protein), die Ran-GTP hydrolyseert waardoor Ran-GDP vormt. In de celkern is dit precies
andersom en de instandhouding van Ran-GTP gereguleerd door Ran-GEF (Guanine Exchange Factor), die
GDP van Ran eraf haalt en GTP erop zet.
Page 2 of 62
,Import van eiwitten ➔ de nucleair import receptor met cargo diffundeert door de NPC de kern in (m.b.v.
FG repeats in fibrillen). Zodra het in de kern is, bindt Ran-GTP aan de nucleair import receptor, waardoor
het zijn cargo loslaat. Het Ran-GTP met de nucleair import receptor gaat weer door de NPC naar het cytosol
en wordt daar gehydrolyseerd door Ran-GAP, waardoor de nucleair import receptor weer vrijkomt en
cargo kan binden. Ran-GDP gaat terug de kern in, waar het door Ran-GEF weer wordt omgezet naar Ran-
GTP (om balans te houden).
Export van eiwitten ➔ de nucleair export receptor met cargo kun tegelijk ook Ran-GTP binden. Het
complex gaat door de NPC naar het cytosol. Hier hydrolyseert Ran-GTP door Ran-GAP tot Ran-GDP,
waardoor de cargo en nucleair export receptor loslaten. De nucleaire export receptor en Ran-GDP gaan
via de NPC weer terug de kern in.
Transcriptie regulators moeten snel de kern in kunnen gaan als dit nodig is. Deze regulators bevinden zich
in het cytosol met een gefosforyleerd nucleair import signaal en een vrij nucleair export signaal, zodat ze
in het cytosol blijven. Zodra er een stimulus is dat ze de kern in moeten, bindt een fosfatase aan de nucleair
export signaal en defosforyleert het nucleair import signaal waardoor dit signaal vrij komt. Hierdoor is de
export geremd en import gestimuleerd, waardoor de regulator snel de kern in kan en transcriptie kan
reguleren.
Page 3 of 62
,Mitochondriaal transport
Het grootste verschil tussen eiwit translocatie in de mitochondriën en de kern, is dat eiwitten ongevouwen
de mitochondriën ingaan (ze kunnen de kern gewoon gevouwen in). Daarnaast zitten er veel verschillende
translocator eiwitten in het mitochondrium membraan. De eiwitten kunnen in 1x of in 2 stappen door het
dubbelmembraan worden getransporteerd.
Tijdens de celdeling delen mitochondria en in planten ook de chloroplasten en gaan daarna weer groeien.
Het grootste deel van het mitochondriale DNA zit in de kern. Maar mitochondriën hebben ook eigen
ribosomen (mito-ribosomen) en DNA door de endosymbiose theorie.
DNA wordt getranscribeerd in de kern, wordt in het cytosol getransleerd en moet vervolgens naar het
mitochondrium. De signaalsequentie van eiwitten die naar het mitochondrium moeten is een amphiphilic
alfa helix, met de hydrofiele groepen aan de ene kant van de helix en de hydrofobe groepen aan de andere
kant. De conformatie wordt door eiwit translocators herkent (meer dan de aminozuur volgorde).
Chaperonnes ontvouwen de eiwitten (door afdekken hydrofobe delen waardoor het eiwit oplosbaar blijft)
en vervolgens wordt de N-terminale signaalsequentie herkend door de import receptors in het TOM
complex. Deze zitten in het buitenmembraan en brengen de eiwitten in de tussenmembraan ruimte. Via
het TIM23 complex in de binnenmembraan komt het eiwit in de matrix. TIM23 en TOM werken vaak
samen om eiwitten tegelijkertijd over de twee membranen te transporteren. In de matrix kan het eiwit
weer vouwen en wordt de signaal peptide eraf geknipt.
In chloroplasten werkt dit hetzelfde, alleen via het TOK en TIK complex.
Page 4 of 62
, Transport over het membraan kost energie:
1) Het loslaten van de cytosolische hsp70 kost ATP
2) De membraanpotentiaal over de binnenmembraan in de mitochondrium wordt gebruikt als
energiebron voor translocatie door TIM. Positieve signaal sequenties kunnen naar negatieve
binnenkant
3) Mitochondriaal hsp70 zit aan de import ATPase. Ze binden en laten het eiwit stuk voor stuk los en
trekken zo het eiwit de matrix in m.b.v. ATP hydrolyse
Het SAM complex zorgt ervoor dat er transmembraan eiwitten in de
buitenmembraan kunnen zitten. Het eiwit komt in de tussenmembraan ruimte via
het TOM complex en wordt oplosbaar gehouden door chaperonnes. Vervolgens kan
het eiwit door het SAM complex meerdere malen door het buitenmembraan
worden getrokken waardoor het transmembraan wordt. Dit zijn vooral bèta-barrel
eiwitten.
In bacteriën zit het BAM complex, dat heel erg lijkt op het SAM complex ➔
bevestigd endosymbiose.
Het plaatsen van transmembraaneiwitten in de binnenmembraan wordt
gereguleerd door TIM23 complex zelf. Het wordt echter geholpen door het OXA
complex.
Van eiwitten die in de tussenmembraan ruimte terecht moeten komen, komt alleen
de N terminal signaal sequentie in de matrix. De signaalsequentie wordt gevolgd door
een (hydrofobe) stop-transfer sequentie om verdere translocatie over het
binnenmembraan te voorkomen. Het overblijfsel van het eiwit kan de
buitenmembraan passeren door TOM.
Peroxisoom transport
Peroxisomen hebben een enkel membraan. Ze zijn zelf-replicerend maar hebben geen genoom, dus al hun
eiwitten worden in de kern gecodeerd. De meeste eiwitten komen van het cytosol en sommige van het
ER. De eiwitten hoeven niet ontvouwen te worden bij import in de peroxisomen, zelfs oligomeren niet. De
poriën gevormd door transporters kunnen hun grootte aanpassen aan de cargo.
Ze bevatten oxiderende enzymen als katalases en oxidases in grote hoeveelheden, waardoor ze goed
zichtbaar zijn als donkere vlek (hoge dichtheid) in de EM. Ze voeren oxidatie reacties uit m.b.v. oxidases,
waarbij waterstofperoxide (H2O2) vormt. Katalase kan H2O2 gebruiken voor oxidatie van bepaalde stoffen
(bv alcohol). De belangrijkste functie van peroxisomen is het afbreken van vetzuurmoleculen middels β-
oxidatie.
Page 5 of 62
Het grootste verschil tussen een prokaryotische en eukaryotische cel is de compartimentalisatie bij
eukaryoten. De celkern en mitochondriën hebben een dubbel membraan, de plasmamembraan en ER
hebben een enkel membraan. Liquid-liquid phase separation is een vorm van compartimentalisatie, maar
zonder membranen.
Cytoplasma = vloeistof met organellen. Cytosol = vloeistof zonder organellen.
Organellen als de kern, mitochondriën en chloroplasten ontstaan niet de novo, maar worden
verdeeld bij deling en groeien vervolgens. Het vesiculair transport ontstaat wel de novo (dus
ook het Golgi). Peroxisomen zijn een uitzondering die zowel niet als wel de novo ontstaan.
Typen transport
1. Moleculaire/gated transport (HC8)
o Diffusie in het membraan
o Diffusie in het cytosol
o Diffusie tussen cytosol en kern
2. Eiwit translocatie (HC8) over een membraan
o Een membraan is hydrofoob, er zijn dus kanalen nodig om hydrofiele
eiwitten er door te laten
3. Vesiculair transport (HC9), afsnoering en fuseren van blaasjes ➔ secretie pathway
o Passief: diffusie
o Actief: cytoskelet
Eiwitten worden specifiek getarget naar een organel via signaalsequenties. Signaal voor
import naar peroxisomen is bv de SKL sequentie (Ser, Lys, Leu) en signaal voor terugkeer naar het ER is de
KDEL sequentie (Lys, Asp, Glu, Leu).
Nucleaire porie complex (NPC)
Eiwitten kunnen zonder te ontvouwen de lipide dubbelmembraan passeren de kern in. De voornamelijke
cargo van de kern naar het cytosol naast mRNA zijn de ribosomen. Die zijn erg groot, wat betekent dat de
nucleaire poriën in de kernmembraan dynamisch en reguleerbaar moeten zijn. De bi-directionele (zowel
import als export) transport snelheid is 1000 moleculen per seconde. De poriën zijn watergevulde kanalen
en bestaan uit veel onderdelen = nucleaire porie complex (NPC). De scaffold en channel nucleoporines
zorgen voor het buigen van het nucleaire dubbelmembraan. De poriën zitten ook in het ER.
Page 1 of 62
,Een NPC bestaat uit 30 verschillende subunits bestaande uit 1000 eiwitten. De celkern heeft 3000-4000 van
dit soort NPCs.
• Kleine moleculen <5 kDa kunnen vrij door de NPC diffunderen
• Eiwitten <60 kDa kunnen er passief doorheen diffunderen, maar gaat langzaam
• Eiwitten >60 kDa moeten actief worden geïmporteerd/geëxporteerd
De signaal sequentie om moleculen de kern in te transporteren is de nuclear localization signal (NLS). De
kern uit exporteren kan met de nuclear export signal (NES).
De NLS is meestal een positieve sequentie en kan zich overal in het eiwit bevinden, maar de oppervlakte
moet wel blootgesteld zijn om te werken.
Als er in de signaal sequentie één mutatie zit, gaat het eiwit al niet meer naar de kern. Dit kan bekeken
worden onder de EM door eiwitten te binden aan goud en daarna de cel te fixeren.
De positieve signaal sequentie bindt aan een nucleair import receptor. Er zijn verschillende import
receptoren om verschillende eiwitten te transporteren. De signaal sequentie kan direct of indirect (via een
nucleair import adapter eiwit) binden aan de import receptor/importine.
Zodra een importine bindt aan NLS van het eiwit kan het vervolgens ook binden aan de FG repeats van
NPC. Deze repeats bevinden zich in de fibrillen. De interactie is van lage affiniteit. Door te bewegen, binden
en los te laten leiden ze het eiwit-receptor complex naar binnen. Het importproces is dus ook
concentratieafhankelijk.
Nucleair transport
Bi-directioneel transport wordt gereguleerd door een diffusiegradiënt van actief en inactief Ran m.b.v.
GTP. In het cytosol wordt het gradiënt Ran-GDP hoog gehouden door aanwezigheid van Ran-GAP (GTPase
Activating Protein), die Ran-GTP hydrolyseert waardoor Ran-GDP vormt. In de celkern is dit precies
andersom en de instandhouding van Ran-GTP gereguleerd door Ran-GEF (Guanine Exchange Factor), die
GDP van Ran eraf haalt en GTP erop zet.
Page 2 of 62
,Import van eiwitten ➔ de nucleair import receptor met cargo diffundeert door de NPC de kern in (m.b.v.
FG repeats in fibrillen). Zodra het in de kern is, bindt Ran-GTP aan de nucleair import receptor, waardoor
het zijn cargo loslaat. Het Ran-GTP met de nucleair import receptor gaat weer door de NPC naar het cytosol
en wordt daar gehydrolyseerd door Ran-GAP, waardoor de nucleair import receptor weer vrijkomt en
cargo kan binden. Ran-GDP gaat terug de kern in, waar het door Ran-GEF weer wordt omgezet naar Ran-
GTP (om balans te houden).
Export van eiwitten ➔ de nucleair export receptor met cargo kun tegelijk ook Ran-GTP binden. Het
complex gaat door de NPC naar het cytosol. Hier hydrolyseert Ran-GTP door Ran-GAP tot Ran-GDP,
waardoor de cargo en nucleair export receptor loslaten. De nucleaire export receptor en Ran-GDP gaan
via de NPC weer terug de kern in.
Transcriptie regulators moeten snel de kern in kunnen gaan als dit nodig is. Deze regulators bevinden zich
in het cytosol met een gefosforyleerd nucleair import signaal en een vrij nucleair export signaal, zodat ze
in het cytosol blijven. Zodra er een stimulus is dat ze de kern in moeten, bindt een fosfatase aan de nucleair
export signaal en defosforyleert het nucleair import signaal waardoor dit signaal vrij komt. Hierdoor is de
export geremd en import gestimuleerd, waardoor de regulator snel de kern in kan en transcriptie kan
reguleren.
Page 3 of 62
,Mitochondriaal transport
Het grootste verschil tussen eiwit translocatie in de mitochondriën en de kern, is dat eiwitten ongevouwen
de mitochondriën ingaan (ze kunnen de kern gewoon gevouwen in). Daarnaast zitten er veel verschillende
translocator eiwitten in het mitochondrium membraan. De eiwitten kunnen in 1x of in 2 stappen door het
dubbelmembraan worden getransporteerd.
Tijdens de celdeling delen mitochondria en in planten ook de chloroplasten en gaan daarna weer groeien.
Het grootste deel van het mitochondriale DNA zit in de kern. Maar mitochondriën hebben ook eigen
ribosomen (mito-ribosomen) en DNA door de endosymbiose theorie.
DNA wordt getranscribeerd in de kern, wordt in het cytosol getransleerd en moet vervolgens naar het
mitochondrium. De signaalsequentie van eiwitten die naar het mitochondrium moeten is een amphiphilic
alfa helix, met de hydrofiele groepen aan de ene kant van de helix en de hydrofobe groepen aan de andere
kant. De conformatie wordt door eiwit translocators herkent (meer dan de aminozuur volgorde).
Chaperonnes ontvouwen de eiwitten (door afdekken hydrofobe delen waardoor het eiwit oplosbaar blijft)
en vervolgens wordt de N-terminale signaalsequentie herkend door de import receptors in het TOM
complex. Deze zitten in het buitenmembraan en brengen de eiwitten in de tussenmembraan ruimte. Via
het TIM23 complex in de binnenmembraan komt het eiwit in de matrix. TIM23 en TOM werken vaak
samen om eiwitten tegelijkertijd over de twee membranen te transporteren. In de matrix kan het eiwit
weer vouwen en wordt de signaal peptide eraf geknipt.
In chloroplasten werkt dit hetzelfde, alleen via het TOK en TIK complex.
Page 4 of 62
, Transport over het membraan kost energie:
1) Het loslaten van de cytosolische hsp70 kost ATP
2) De membraanpotentiaal over de binnenmembraan in de mitochondrium wordt gebruikt als
energiebron voor translocatie door TIM. Positieve signaal sequenties kunnen naar negatieve
binnenkant
3) Mitochondriaal hsp70 zit aan de import ATPase. Ze binden en laten het eiwit stuk voor stuk los en
trekken zo het eiwit de matrix in m.b.v. ATP hydrolyse
Het SAM complex zorgt ervoor dat er transmembraan eiwitten in de
buitenmembraan kunnen zitten. Het eiwit komt in de tussenmembraan ruimte via
het TOM complex en wordt oplosbaar gehouden door chaperonnes. Vervolgens kan
het eiwit door het SAM complex meerdere malen door het buitenmembraan
worden getrokken waardoor het transmembraan wordt. Dit zijn vooral bèta-barrel
eiwitten.
In bacteriën zit het BAM complex, dat heel erg lijkt op het SAM complex ➔
bevestigd endosymbiose.
Het plaatsen van transmembraaneiwitten in de binnenmembraan wordt
gereguleerd door TIM23 complex zelf. Het wordt echter geholpen door het OXA
complex.
Van eiwitten die in de tussenmembraan ruimte terecht moeten komen, komt alleen
de N terminal signaal sequentie in de matrix. De signaalsequentie wordt gevolgd door
een (hydrofobe) stop-transfer sequentie om verdere translocatie over het
binnenmembraan te voorkomen. Het overblijfsel van het eiwit kan de
buitenmembraan passeren door TOM.
Peroxisoom transport
Peroxisomen hebben een enkel membraan. Ze zijn zelf-replicerend maar hebben geen genoom, dus al hun
eiwitten worden in de kern gecodeerd. De meeste eiwitten komen van het cytosol en sommige van het
ER. De eiwitten hoeven niet ontvouwen te worden bij import in de peroxisomen, zelfs oligomeren niet. De
poriën gevormd door transporters kunnen hun grootte aanpassen aan de cargo.
Ze bevatten oxiderende enzymen als katalases en oxidases in grote hoeveelheden, waardoor ze goed
zichtbaar zijn als donkere vlek (hoge dichtheid) in de EM. Ze voeren oxidatie reacties uit m.b.v. oxidases,
waarbij waterstofperoxide (H2O2) vormt. Katalase kan H2O2 gebruiken voor oxidatie van bepaalde stoffen
(bv alcohol). De belangrijkste functie van peroxisomen is het afbreken van vetzuurmoleculen middels β-
oxidatie.
Page 5 of 62
