Week 1 Isolatie en activiteitsbepaling
Twee thema’s centraal
1. Enzymzuivering en het monitoren hiervan
Zuiveren: Blender, kolomchromotografie
Monitoren: activiteit, concen
tratie, visualisatie
2. Enzymkinetiek (specifiteit en parameters)
Specifiteit: 3D-visualisatie, co-enzymdetectie
Parameters: Maximale enzymsnelheid, substraataffiniteit
In een eiwit komen verschillende structuren voor. Zo
komt in de secundaire structuur de alfa helixen en de
beta sheets voor. De alfa helix is te vergelijken met een
golfplaat en een beta sheet is opgerold. In de tertiare
structuur komen deze twee samen en wordt dit in elkaar
opgerold tot een eiwit, dit noemen we de quantenaire
structuur.
Figuur 1 Tertiare structuur van eiwitten
Een enzym moet in de transitie toestand komen. Hierbij wordt het substraat in het
enzym zo vervormd dat het de activeringsenergie verlaagt en zo de reactie makkelijker
kan verlopen.
Figuur 2 Enzym verlaagt de activeringsenergie
Een enzym heeft een aantal kenmerken, zoals:
o Komt onveranderd uit de reactie
o Katalyseert zowel de heen- als teruggaande reactie
o Beïnvloedt niet de ligging van het evenwicht
o De reactie blijft afhankelijk van de temperatuur
Co-enzymen (zoals NADH) zijn organische
verbindingen die een rol vervullen bij
enzymatische omzettingen. Een enzym kan
een bepaald co-enzym nodig hebben om een
reactie te versnellen.
De activiteit van een enzym wordt bepaald doorFiguur
de verandering van de hoeveelheid
3 co-enzymen (NADH)
substraat te meten per tijdseenheid.
LDH wordt gemeten door de afname van NADH te meten bij 340 nm.
Verschillende voorbeelden van homogeniseren (verkleinen van deeltjes):
o Sonificatie
, o Blender
o Osmotische shock
Bij een mengbuffer wordt het zuur en de base in één keer bij elkaar gevoegd en bij een
titratiebuffer wordt het zuur of base als eerst toegevoegd en vervolgens tot de juiste ph
met de ander aangevuld.
IU ( International Unit): 1 IU komt overeen met de hoeveelheid enzym die nodig is voor
de omzetting van 1 µmol substraat per minuut bij 25oC onder optimale omstandigheden.
Katal (kat): 1 katal komt overeen met de hoeveelheid enzym die nodig is voor de
omzetting van 1 mol substraat per seconde bij 25oC onder optimale omstandigheden.
De hoeveelheid enzymen moeten altijd in overmaat zijn zodat al het substraat zich kan
binden. De omzettingssnelheid is de maat voor de hoeveelheid enzym.
Wet van Lambert-Beer: A = ε * c * l
A : Extinctie (absorbantie)
c : Concentratie (mol/L)
l : Weglengte (cm)
ε : Molaire extinctie coëfficiënt (L*(mol*cm)
De wet van Lambert-Beer kan ook op een andere manier gebruikt worden, namelijk:
Vo= (ΔA/Δt)/(ε*l) (ε is vaak 6220)A/ΔA/Δt)/(ε*l) (ε is vaak 6220)t)/(ε*l) (ε is vaak 6220)
Betrouwbaarheidsintervallen
Is dat er wordt een gebied aangegeven, waarin het werkelijke gemiddelde (μ van de
populatie) waarschijnlijk ligt.
Wanneer de sigma gegeven is: 𝑥- − 𝑧 ∗ 𝜎/𝑛 < µ < 𝑥- + 𝑧 ∗ 𝜎/𝑛
Twee thema’s centraal
1. Enzymzuivering en het monitoren hiervan
Zuiveren: Blender, kolomchromotografie
Monitoren: activiteit, concen
tratie, visualisatie
2. Enzymkinetiek (specifiteit en parameters)
Specifiteit: 3D-visualisatie, co-enzymdetectie
Parameters: Maximale enzymsnelheid, substraataffiniteit
In een eiwit komen verschillende structuren voor. Zo
komt in de secundaire structuur de alfa helixen en de
beta sheets voor. De alfa helix is te vergelijken met een
golfplaat en een beta sheet is opgerold. In de tertiare
structuur komen deze twee samen en wordt dit in elkaar
opgerold tot een eiwit, dit noemen we de quantenaire
structuur.
Figuur 1 Tertiare structuur van eiwitten
Een enzym moet in de transitie toestand komen. Hierbij wordt het substraat in het
enzym zo vervormd dat het de activeringsenergie verlaagt en zo de reactie makkelijker
kan verlopen.
Figuur 2 Enzym verlaagt de activeringsenergie
Een enzym heeft een aantal kenmerken, zoals:
o Komt onveranderd uit de reactie
o Katalyseert zowel de heen- als teruggaande reactie
o Beïnvloedt niet de ligging van het evenwicht
o De reactie blijft afhankelijk van de temperatuur
Co-enzymen (zoals NADH) zijn organische
verbindingen die een rol vervullen bij
enzymatische omzettingen. Een enzym kan
een bepaald co-enzym nodig hebben om een
reactie te versnellen.
De activiteit van een enzym wordt bepaald doorFiguur
de verandering van de hoeveelheid
3 co-enzymen (NADH)
substraat te meten per tijdseenheid.
LDH wordt gemeten door de afname van NADH te meten bij 340 nm.
Verschillende voorbeelden van homogeniseren (verkleinen van deeltjes):
o Sonificatie
, o Blender
o Osmotische shock
Bij een mengbuffer wordt het zuur en de base in één keer bij elkaar gevoegd en bij een
titratiebuffer wordt het zuur of base als eerst toegevoegd en vervolgens tot de juiste ph
met de ander aangevuld.
IU ( International Unit): 1 IU komt overeen met de hoeveelheid enzym die nodig is voor
de omzetting van 1 µmol substraat per minuut bij 25oC onder optimale omstandigheden.
Katal (kat): 1 katal komt overeen met de hoeveelheid enzym die nodig is voor de
omzetting van 1 mol substraat per seconde bij 25oC onder optimale omstandigheden.
De hoeveelheid enzymen moeten altijd in overmaat zijn zodat al het substraat zich kan
binden. De omzettingssnelheid is de maat voor de hoeveelheid enzym.
Wet van Lambert-Beer: A = ε * c * l
A : Extinctie (absorbantie)
c : Concentratie (mol/L)
l : Weglengte (cm)
ε : Molaire extinctie coëfficiënt (L*(mol*cm)
De wet van Lambert-Beer kan ook op een andere manier gebruikt worden, namelijk:
Vo= (ΔA/Δt)/(ε*l) (ε is vaak 6220)A/ΔA/Δt)/(ε*l) (ε is vaak 6220)t)/(ε*l) (ε is vaak 6220)
Betrouwbaarheidsintervallen
Is dat er wordt een gebied aangegeven, waarin het werkelijke gemiddelde (μ van de
populatie) waarschijnlijk ligt.
Wanneer de sigma gegeven is: 𝑥- − 𝑧 ∗ 𝜎/𝑛 < µ < 𝑥- + 𝑧 ∗ 𝜎/𝑛
