Moleculair genetische onderzoekstechnieken – DT1
HC2: Uitwisseling genetisch materiaal bacteriën
MGOT gebruikt micro-organismen voor:
-snelle reproductie
-snelle evolutie
-diversiteit aan adaptaties (extreem)
-uitwisseling genetisch materiaal (conjugatie)
Uitwisseling genetisch materiaal bacteriën
-verticaal ouder-nakomeling, horizontaal tussen twee micro-organismen
Genetisch materiaal
-prokaryoten circulair DNA, eukaryoten lineair (behalve organellen, mitochondriën,
chloroplasten)
-plasmiden/vector/construct (circulair klein DNA) in eukaryoten
-vergroot aanpassingsvermogen: resistentie, metabolisme, pathogeniteit, symbiose
-niet essentieel, 1000 bekend, 1>100 kopieën per cel, <5% chromosoom grootte (1kbp-
1Mbp)
DNA vouwing prokaryoten
-supercoiling door topoisomerase II (gyrase)
Replicatie prokaryoot – verticale genoverdracht
,-topoisomerase ontwind DNA, helicase bindt, replicatie door DNAPIII (lead 5’-3’)
-40min chromsoom replicatie, 20min vormen nieuwe cel
-meerdere replicatievorken in vorken 1 cel (multifork) -> al weer afsplitsing -> exponentieel
Horizontale genoverdracht
Transformatie – veel in lab
-cel neemt DNA op uit omgeving (verwant) met retracing pilus of via vesicles
-bij plakken aan DNA retractie
-opname, want rijk aan bouwstoffen (C/N/P) en chromosoomintegratie
-nuclease maakt DNA enkelstrengs, RecA herkent overeenkomsten DNA -> cross-over
transformatie
,-in lab werken met bacterie die niks opneemt -> gram negatief (E. coli)
-transformatie in lab met heat shock of electroporatie
-competente cellen op ijs, plasmide toevoegen op ijs, calciumchloride brengt plasmide
bij lipopolisacharide (ladingsverschillen), dan heat shock (30s-1min), membraan
permeabel, daarna recovery op ijs, groeimedium toevoegen -> regeneratie, plating +
antibiotica die de plasmide niet hebben
Transductie via virussen (bacteriofagen)
-ook DNA materiaal van andere bacteriën
-herkenning via:
-proces homologe recombinatie (crossing-over) -> recombinante cel
, Conjugatie via pilus
-5 min voor 100kbp
-F-plasmiden (fertility) nodig die coderen voor transfer genen (Tra) die coderen voor pilus
-ongeveer 25 genen Tra
-High frequency recombination (Hfr) als F-plasmiden integreren in chromosoom
-één streng komt los van plasmide/chromosoom
HC3: DNA mutaties en herstelmechanismen
Plasmide prokaryoot
-ori -> compatibiliteit, host range en copy nummer
HC2: Uitwisseling genetisch materiaal bacteriën
MGOT gebruikt micro-organismen voor:
-snelle reproductie
-snelle evolutie
-diversiteit aan adaptaties (extreem)
-uitwisseling genetisch materiaal (conjugatie)
Uitwisseling genetisch materiaal bacteriën
-verticaal ouder-nakomeling, horizontaal tussen twee micro-organismen
Genetisch materiaal
-prokaryoten circulair DNA, eukaryoten lineair (behalve organellen, mitochondriën,
chloroplasten)
-plasmiden/vector/construct (circulair klein DNA) in eukaryoten
-vergroot aanpassingsvermogen: resistentie, metabolisme, pathogeniteit, symbiose
-niet essentieel, 1000 bekend, 1>100 kopieën per cel, <5% chromosoom grootte (1kbp-
1Mbp)
DNA vouwing prokaryoten
-supercoiling door topoisomerase II (gyrase)
Replicatie prokaryoot – verticale genoverdracht
,-topoisomerase ontwind DNA, helicase bindt, replicatie door DNAPIII (lead 5’-3’)
-40min chromsoom replicatie, 20min vormen nieuwe cel
-meerdere replicatievorken in vorken 1 cel (multifork) -> al weer afsplitsing -> exponentieel
Horizontale genoverdracht
Transformatie – veel in lab
-cel neemt DNA op uit omgeving (verwant) met retracing pilus of via vesicles
-bij plakken aan DNA retractie
-opname, want rijk aan bouwstoffen (C/N/P) en chromosoomintegratie
-nuclease maakt DNA enkelstrengs, RecA herkent overeenkomsten DNA -> cross-over
transformatie
,-in lab werken met bacterie die niks opneemt -> gram negatief (E. coli)
-transformatie in lab met heat shock of electroporatie
-competente cellen op ijs, plasmide toevoegen op ijs, calciumchloride brengt plasmide
bij lipopolisacharide (ladingsverschillen), dan heat shock (30s-1min), membraan
permeabel, daarna recovery op ijs, groeimedium toevoegen -> regeneratie, plating +
antibiotica die de plasmide niet hebben
Transductie via virussen (bacteriofagen)
-ook DNA materiaal van andere bacteriën
-herkenning via:
-proces homologe recombinatie (crossing-over) -> recombinante cel
, Conjugatie via pilus
-5 min voor 100kbp
-F-plasmiden (fertility) nodig die coderen voor transfer genen (Tra) die coderen voor pilus
-ongeveer 25 genen Tra
-High frequency recombination (Hfr) als F-plasmiden integreren in chromosoom
-één streng komt los van plasmide/chromosoom
HC3: DNA mutaties en herstelmechanismen
Plasmide prokaryoot
-ori -> compatibiliteit, host range en copy nummer
