Leerdoelen moleculaire microbiologie VL5 2020
Les 1 & 2: AMPLIFICATIETECHNIEKENVOORDETECTIEVANMICRO-ORGANISMEN
De mijlpalen van de moleculaire technieken:
- James Watson en Francis Crick (1953) Ontrafeling dubbele helixstructuur. De beide strengen zijn
ook naar deze mannen vernoemd: Watson-streng en Crick-streng.
- Fred Sanger (1975) Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek
- Kary Mullis (1983) Uitvinding Polymerase Chain Reaction (PCR),
- Roche (1992) Eerste commerciële moleculaire tests
Welke technieken zijn er voor de identificatie van bacteriën:
- MALDI-TOF
- PCR
- Sequencing
- Microscopie
- Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur
van nucleïnezuren
Structuur van DNA nucleotiden:
- Fosfaatgroep (buitenkant)
- Suikergroep (midden)
- Base (binnenkant)
Purines: Adenine (A) en Guanine (G)
• Eigenschappen en enzym activiteit van DNA polymerase
Pyrimidines: Thyme (T) en Cytosine (C)
1. De meeste DNA polymerasen hebben een template nodig.
2. Alle DNA polymerasen hebben een beginstukje nodig, dit
De basen vormen waterstofbruggen (H-bruggen):
kan bestaan uit RNA of DNA (=primer).
A tegenover T -> twee H-bruggen.
3. Alle DNA polymerasen synthetiseren DNA van 5’ naar 3’
C tegenover G -> drie H-bruggen, zijn dus sterker.
richting.
Verschil DNA en RNA 4. Sommige DNA polymerasen hebben exonuclease
activiteit:
- van 3’ → 5’ voor proofreading
- van 5’ → 3’ weghalen primer
Waarom DNa synthese van 5’naar 3’?
Elongatie van 5’ naar 3’ kan doorgaan als een fout wordt
verwijdert door de exonuclease proofreading activiteit. Als de
elongatie van 3’ naar 5’ zou zijn, dan wordt door proofreading
de elongatie geblokkeerd. Dit komt omdat er geen trifosfaat
(energie) meer beschikbaar is.
Exonuclease activiteiten van DNA polymerase:
De basen vormen waterstofbruggen (H-bruggen): - Primer weghalen (displaced nucleotiden van 5’naar 3’)
A tegenover T -> twee H-bruggen. - Proofreading ( incorrecte nucleotide van 3’naar 5’)
C tegenover G -> drie H-bruggen, zijn dus sterker.
Niet alle DNA polymerases hebben beide exonuclease
activiteiten.
Endonuclease = knipt vanuit binnen het DNA
Exonuclease = knipt vanaf zijkant het DNA.
,- Kan de verschillen de componenten van een PCR mix benoemen
Voor een PCR zijn er verschillende vereisten, zoals specifieke technische handelingen, reagentia,
bekwaam personeel en er zijn minimaal 3 verschillende labruimtes nodig:
I. Pre-PCR (mix kamer) de schone ruimte
II. Vieze ruimt DNA/RNA product wordt toegevoegd.
III. PCR apparaat
IV. Gelruimte
Eénmaal uit de schone ruimte, blijft uit de schone ruimte kans op contaminatie.
Voor het uitvoeren van een PCR moet er een primer ontworpen worden. Van het target DNA of RNA
moet de sequentie bekend zijn voor het maken van de primers.
Alle componenten voor een PCR zijn:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTPs (20-200 NM van alle 4 de dNTPs. Een te hoge concentratie kan synthesefouten
veroorzaken.)
- PCR-buffer (Tris-HCl buffer van pH = 7,8 is optimaal. Optioneel zijn Tween (stabiliseert Taq) , BSA,
eenwaardige ionen.)
- Taq-DNA polymerase
- MgCl2, essentiële co-factor voor Taq- en heeft stabiliserend effect
- Primers (en of probes)
Polymerase enzym
Taq-DNA-polymerase (Thermus aquaticus)
- Essentieel: hittestabiel
- Snelle synthese
- Géén 3'-5'exonucleoase activiteit, dus géén proofreading
- Nadeel: niet handig om te gebruiken voor een gen isolatie, en is gevoelig voor allerlei remmende
stoffen.
Polymerase remmers
- Proteolytische enzymen (pronase, proteinase K)
- Heparine, ijzerionen porfyrine-skeletten (bloed)
- DMSO (hoge concentratie)
- Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
- SDS
- Ureum.
(Dus belangrijk dat de zuivering goed en netjes gaat!!)
PCR en Q-PCR worden gebruikt als identificatie methode op een moleculair lab:
- Soort specifieke amplificatie van het 16s rDNA gen.
- Amplificatie van soort specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (huishoud genen)
- Amplificatie van resistentie genen (MICA-PCR)
- Amplificatie van het hele genoom
Conserved regionen: niet specifieke regionen, zijn nodig voor de functie van het eiwit. Kunnen niet
gebruikt worden voor de identificatie
,Variabele regionen: groep of soort specifieke regionen, zijn niet nodig voor de functie van het eiwit
en daarom kan hier gemakkelijk een mutatie plaats vinden. Kunnen wel gebruikt worden voor
identificatie.
Reverse transcriptase: van RNA cDNA maken. RNA moet daarvoor wel eerst denatureren en daarna
meteen op ijs, hierdoor blijft het lineair.
- Herkent sense en anti-sense sequenties
Sense sequentie codeert van het RNA dat betrokken is bij de vorming van eiwitten: 3’ 5’
Anti-sense sequentie die niet coderende streng welke complementair is aan de coderende streng: 5’
3’
- Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten
voldoen & weet welke factoren van belang zijn bij het
ontwerpen van primers/probes
Primers:
- Ongeveer tussen de 18-25 nucleotiden lang
- Anneaelingtemperatuur (is afhankelijk van de primers, binding
van primers moet mogelijk)
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40%-70%). Hoe meer
GC’s dan is de annaelingstemperatuur ook hoger
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen de twee
primers (primer-dimeer)
- Geen homologie met eigen sequentie waardoor er loops of hairpins kunnen worden gevormd.
- Amplicon b.v.k. 75–200 bp. Hoogste efficientie.
- Smeltemperatur (Tm) tussen ca 50ºC and 65ºC.
Mogelijkheid 1 = homologe verbinding, bindt op de goede plek.
Mogelijkheid 2 = bij klonering, dan wordt een bepaald gen geïsoleerd. Wanneer er wordt gekloneerd
wordt aan de doelsequentie een restrictie-zijde aan vast gemaakt.
Mogelijkheid 3 = primer bindt, en dan begint de elongatie. Bij de elongatie zal de polymerase binden
aan een stuk dsDNA. Er zal wel stress op het molecuul plaatsvinden waardoor de binding niet
optimaal is.
Mogelijkheid 4 = Geen amplificatie, want de polymerase kan de strengen niet goed bij elkaar
brengen.
Wanneer de doelsequentie bekend is zal er worden geblast (blastentool bij NCBI).
- Blasten: Vergelijken van de sequentie die men in handen heeft met een database. Hierbij wil je
alleen het desbetreffende organisme terugkrijgen waar je naar opzoek bent.
- Alignment: Hiermee kan worden gecontroleerd of er mutaties zijn opgetreden en hierdoor het
mogelijk is om daar een primer te ontwerpen om zo wel alle doelorganismen te verkrijgen
Probe:
- Probe moet eerder binden op het DNA dan de primers (TM is ongeveer 60-70 graden). Tm moet
hoog zijn omdat er anders geen signaal ontstaat.
- GC-gehalte moet tussen de 20 en 80 % zijn.
- En mag geen lange herhaling van nucleotide in de probe zitten.
- Er mogen geen G’s aan de 5’ kant zitten aangezien dit kan leiden tot extra quenching (uitdoving van
, het signaal).
- Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
Een DNA bindende stof kan gebruikt worden om de test te
kwantificeren bijvoorbeeld met SYBR Green. Een andere manier
om de test te kwantificeren, is door hydrolyserende probes
(fluorofor quencher).
SYBR
Bindt aan elk dsDNA en zal fluoresceren wanneer gebonden is
(detecteert dus specifiek en aspecifiek en dus ook primer-
interacties), hiervoor is geen probe voor nodig. Bij SYBR word een
smeltcurve-analyse uitgevoerd, ter controle van de lengte van het
product en of er maar 1 soort is gevormd. Hierbij moet de Tm
binnen de 0,5℃ liggen van wat er wordt verwacht.
Taq-man
Bestaat uit een fluorofor (aan de 5’ zijde gebonden) en een quencher (aan de 3’ zijde gebonden).
Wanneer de polymerase het fluorofor tegen komt zal deze vrij in de oplossing terecht komen. De
quencher zal de fluorescentie van het fluorfor gaan uitdoven wanneer deze ook in de oplossing
terecht komt, dit is te meten door middel van fluorescentie. Gelabelde oligonucleotide probe +
specifieke primers. Voordeel ten opzichten van de cyber green = specifieke primers, ook probe nodig
die specifiek is.
5' fluorescerent reporter - 3' quencher
Intact: reporter is “gedoofd” door nabijheid quencher.
Annealing: probe en primers hybridiseren aan target
Extensie primers: 5'—> 3' exonuclease activiteit Taq or Tth klieft probe
- Begrijpt het principe van realtime PCR
De Real-Time PCR (RT-PCR) is een amplificatietechniek waarbij de toename van het DNA in de
reageerbuis op elk moment kan gevolgd worden. Deze techniek is gebaseerd op een ingenieus
systeem waarbij een kleurstof wordt vrij gezet bij elke vermenigvuldiging van het DNA. Nu is de
snelheid van amplificatie afhankelijk van de hoeveelheid DNA in het staal. Met behulp van speciale
lasergebaseerde automaten kan de kleurontwikkeling gemeten worden en de oorspronkelijke
hoeveelheid van het op te sporen DNA bepaald worden.
Les 1 & 2: AMPLIFICATIETECHNIEKENVOORDETECTIEVANMICRO-ORGANISMEN
De mijlpalen van de moleculaire technieken:
- James Watson en Francis Crick (1953) Ontrafeling dubbele helixstructuur. De beide strengen zijn
ook naar deze mannen vernoemd: Watson-streng en Crick-streng.
- Fred Sanger (1975) Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek
- Kary Mullis (1983) Uitvinding Polymerase Chain Reaction (PCR),
- Roche (1992) Eerste commerciële moleculaire tests
Welke technieken zijn er voor de identificatie van bacteriën:
- MALDI-TOF
- PCR
- Sequencing
- Microscopie
- Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur
van nucleïnezuren
Structuur van DNA nucleotiden:
- Fosfaatgroep (buitenkant)
- Suikergroep (midden)
- Base (binnenkant)
Purines: Adenine (A) en Guanine (G)
• Eigenschappen en enzym activiteit van DNA polymerase
Pyrimidines: Thyme (T) en Cytosine (C)
1. De meeste DNA polymerasen hebben een template nodig.
2. Alle DNA polymerasen hebben een beginstukje nodig, dit
De basen vormen waterstofbruggen (H-bruggen):
kan bestaan uit RNA of DNA (=primer).
A tegenover T -> twee H-bruggen.
3. Alle DNA polymerasen synthetiseren DNA van 5’ naar 3’
C tegenover G -> drie H-bruggen, zijn dus sterker.
richting.
Verschil DNA en RNA 4. Sommige DNA polymerasen hebben exonuclease
activiteit:
- van 3’ → 5’ voor proofreading
- van 5’ → 3’ weghalen primer
Waarom DNa synthese van 5’naar 3’?
Elongatie van 5’ naar 3’ kan doorgaan als een fout wordt
verwijdert door de exonuclease proofreading activiteit. Als de
elongatie van 3’ naar 5’ zou zijn, dan wordt door proofreading
de elongatie geblokkeerd. Dit komt omdat er geen trifosfaat
(energie) meer beschikbaar is.
Exonuclease activiteiten van DNA polymerase:
De basen vormen waterstofbruggen (H-bruggen): - Primer weghalen (displaced nucleotiden van 5’naar 3’)
A tegenover T -> twee H-bruggen. - Proofreading ( incorrecte nucleotide van 3’naar 5’)
C tegenover G -> drie H-bruggen, zijn dus sterker.
Niet alle DNA polymerases hebben beide exonuclease
activiteiten.
Endonuclease = knipt vanuit binnen het DNA
Exonuclease = knipt vanaf zijkant het DNA.
,- Kan de verschillen de componenten van een PCR mix benoemen
Voor een PCR zijn er verschillende vereisten, zoals specifieke technische handelingen, reagentia,
bekwaam personeel en er zijn minimaal 3 verschillende labruimtes nodig:
I. Pre-PCR (mix kamer) de schone ruimte
II. Vieze ruimt DNA/RNA product wordt toegevoegd.
III. PCR apparaat
IV. Gelruimte
Eénmaal uit de schone ruimte, blijft uit de schone ruimte kans op contaminatie.
Voor het uitvoeren van een PCR moet er een primer ontworpen worden. Van het target DNA of RNA
moet de sequentie bekend zijn voor het maken van de primers.
Alle componenten voor een PCR zijn:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTPs (20-200 NM van alle 4 de dNTPs. Een te hoge concentratie kan synthesefouten
veroorzaken.)
- PCR-buffer (Tris-HCl buffer van pH = 7,8 is optimaal. Optioneel zijn Tween (stabiliseert Taq) , BSA,
eenwaardige ionen.)
- Taq-DNA polymerase
- MgCl2, essentiële co-factor voor Taq- en heeft stabiliserend effect
- Primers (en of probes)
Polymerase enzym
Taq-DNA-polymerase (Thermus aquaticus)
- Essentieel: hittestabiel
- Snelle synthese
- Géén 3'-5'exonucleoase activiteit, dus géén proofreading
- Nadeel: niet handig om te gebruiken voor een gen isolatie, en is gevoelig voor allerlei remmende
stoffen.
Polymerase remmers
- Proteolytische enzymen (pronase, proteinase K)
- Heparine, ijzerionen porfyrine-skeletten (bloed)
- DMSO (hoge concentratie)
- Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
- SDS
- Ureum.
(Dus belangrijk dat de zuivering goed en netjes gaat!!)
PCR en Q-PCR worden gebruikt als identificatie methode op een moleculair lab:
- Soort specifieke amplificatie van het 16s rDNA gen.
- Amplificatie van soort specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (huishoud genen)
- Amplificatie van resistentie genen (MICA-PCR)
- Amplificatie van het hele genoom
Conserved regionen: niet specifieke regionen, zijn nodig voor de functie van het eiwit. Kunnen niet
gebruikt worden voor de identificatie
,Variabele regionen: groep of soort specifieke regionen, zijn niet nodig voor de functie van het eiwit
en daarom kan hier gemakkelijk een mutatie plaats vinden. Kunnen wel gebruikt worden voor
identificatie.
Reverse transcriptase: van RNA cDNA maken. RNA moet daarvoor wel eerst denatureren en daarna
meteen op ijs, hierdoor blijft het lineair.
- Herkent sense en anti-sense sequenties
Sense sequentie codeert van het RNA dat betrokken is bij de vorming van eiwitten: 3’ 5’
Anti-sense sequentie die niet coderende streng welke complementair is aan de coderende streng: 5’
3’
- Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten
voldoen & weet welke factoren van belang zijn bij het
ontwerpen van primers/probes
Primers:
- Ongeveer tussen de 18-25 nucleotiden lang
- Anneaelingtemperatuur (is afhankelijk van de primers, binding
van primers moet mogelijk)
- Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40%-70%). Hoe meer
GC’s dan is de annaelingstemperatuur ook hoger
- Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
- Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen de twee
primers (primer-dimeer)
- Geen homologie met eigen sequentie waardoor er loops of hairpins kunnen worden gevormd.
- Amplicon b.v.k. 75–200 bp. Hoogste efficientie.
- Smeltemperatur (Tm) tussen ca 50ºC and 65ºC.
Mogelijkheid 1 = homologe verbinding, bindt op de goede plek.
Mogelijkheid 2 = bij klonering, dan wordt een bepaald gen geïsoleerd. Wanneer er wordt gekloneerd
wordt aan de doelsequentie een restrictie-zijde aan vast gemaakt.
Mogelijkheid 3 = primer bindt, en dan begint de elongatie. Bij de elongatie zal de polymerase binden
aan een stuk dsDNA. Er zal wel stress op het molecuul plaatsvinden waardoor de binding niet
optimaal is.
Mogelijkheid 4 = Geen amplificatie, want de polymerase kan de strengen niet goed bij elkaar
brengen.
Wanneer de doelsequentie bekend is zal er worden geblast (blastentool bij NCBI).
- Blasten: Vergelijken van de sequentie die men in handen heeft met een database. Hierbij wil je
alleen het desbetreffende organisme terugkrijgen waar je naar opzoek bent.
- Alignment: Hiermee kan worden gecontroleerd of er mutaties zijn opgetreden en hierdoor het
mogelijk is om daar een primer te ontwerpen om zo wel alle doelorganismen te verkrijgen
Probe:
- Probe moet eerder binden op het DNA dan de primers (TM is ongeveer 60-70 graden). Tm moet
hoog zijn omdat er anders geen signaal ontstaat.
- GC-gehalte moet tussen de 20 en 80 % zijn.
- En mag geen lange herhaling van nucleotide in de probe zitten.
- Er mogen geen G’s aan de 5’ kant zitten aangezien dit kan leiden tot extra quenching (uitdoving van
, het signaal).
- Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
Een DNA bindende stof kan gebruikt worden om de test te
kwantificeren bijvoorbeeld met SYBR Green. Een andere manier
om de test te kwantificeren, is door hydrolyserende probes
(fluorofor quencher).
SYBR
Bindt aan elk dsDNA en zal fluoresceren wanneer gebonden is
(detecteert dus specifiek en aspecifiek en dus ook primer-
interacties), hiervoor is geen probe voor nodig. Bij SYBR word een
smeltcurve-analyse uitgevoerd, ter controle van de lengte van het
product en of er maar 1 soort is gevormd. Hierbij moet de Tm
binnen de 0,5℃ liggen van wat er wordt verwacht.
Taq-man
Bestaat uit een fluorofor (aan de 5’ zijde gebonden) en een quencher (aan de 3’ zijde gebonden).
Wanneer de polymerase het fluorofor tegen komt zal deze vrij in de oplossing terecht komen. De
quencher zal de fluorescentie van het fluorfor gaan uitdoven wanneer deze ook in de oplossing
terecht komt, dit is te meten door middel van fluorescentie. Gelabelde oligonucleotide probe +
specifieke primers. Voordeel ten opzichten van de cyber green = specifieke primers, ook probe nodig
die specifiek is.
5' fluorescerent reporter - 3' quencher
Intact: reporter is “gedoofd” door nabijheid quencher.
Annealing: probe en primers hybridiseren aan target
Extensie primers: 5'—> 3' exonuclease activiteit Taq or Tth klieft probe
- Begrijpt het principe van realtime PCR
De Real-Time PCR (RT-PCR) is een amplificatietechniek waarbij de toename van het DNA in de
reageerbuis op elk moment kan gevolgd worden. Deze techniek is gebaseerd op een ingenieus
systeem waarbij een kleurstof wordt vrij gezet bij elke vermenigvuldiging van het DNA. Nu is de
snelheid van amplificatie afhankelijk van de hoeveelheid DNA in het staal. Met behulp van speciale
lasergebaseerde automaten kan de kleurontwikkeling gemeten worden en de oorspronkelijke
hoeveelheid van het op te sporen DNA bepaald worden.
