College 9: genomes and genomics (H14)
Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken, strategieën formuleren om onderzoekshypotheses te
testen:
DNA extractie
1. cellen verzamelen van het test subject (bv uit wangslijmvlies).
- met wattenstaafje aan de binnenkant vd wang strijken
- plaats wattenstaafje in epje (knip de punt vh wattenstaafje eraf)
2. barst cellen open om DNA vrij te laten komen.
- pipetteer lysis buffer in het epje met het stukje wattenstaaf.
- plaats dan het epje in een warmwaterbad
- lysis buffer bestaat uit detergent (laat de cellen openbarsten waardoor het DNA vrijkomt) en enzym
proteinase K (knipt histonen eruit waardoor DNA vrijkomt)
3. scheidt het DNA van eiwitten en puin (debris).
- pipetteer geconcentreerde zoutoplossing in het epje (epje is uit het warmwaterbad). Hierdoor gaat al het
niet-DNA (zoals eiwitten) samenklonteren
- plaats epje in centrifuge. Hierdoor bevindt het samengeklonterde niet-DNA zich onderin het epje na het
centrifugeren
- pipetteer dan de bovenste (DNA) vloeistof in een nieuw epje.
4. isoleer het geconcentreerde DNA.
- pipetteer dan isopropyl alcohol in het nieuwe epje. Dit maakt het DNA zichtbaar met blote oog.
- centrifugeer het epje dan weer.
- pipetteer dan de bovenste vloeistof (alcohol?), je houdt dan het geconcentreerde DNA over.
mRNA extractie
Kan bv door: metaalballetjes waaraan polytae is vastgemaakt. Aan poltae binden de poly-a-staarten van mRNA.
Dit is een opzuiveringsstap.
cDNA productie
Voorbeeld: oxytocine receptor agonist.
Stap 1: breng humaan gen tot expressie in een ander organisme. We zijn eigenlijk alleen geïnteresseerd in het
eiwit, en dus isoleren we het mRNA (gen is onduidelijk concept; want intronen, exonen, UTR’s, promotor etc).
Hoe vinden we mRNA van een bekend gen?
1. isoleer al het mRNA uit weefsel
- kan bv door: metaalballetjes waaraan polytae is vastgemaakt. Aan poltae binden de
poly-a-staarten van mRNA. Dit is een opzuiveringsstap
2. vervolgens produceren we selectief het oxytocine receptor cDNA dmv reverse transcriptase
- RNA virussen bevatten een RNA genoom (enkel of dubbelstrengs). Retrovirussen bevatten
een RNA genoom maar produceren een DNA kopie die intercaleert in het genoom in de
gastheer (provirus). Door reverse transcriptase.
- twee opties om cDNA te produceren, zie plaatje.
- optie 1: primer gebruiken die op de poly-a-staart gaat zitten (poly-t). Je
krijgt de hele streng, geen specifiek stukje.
- optie 2: specifieke primer gebruiken. In ons geval. Je krijgt een
specifiek stukje.
- dmv reverse transcriptase kunnen we ons stukje DNA vermeerderen. En eventueel mbv PCR
het stukje heel vaak vermeerderen
3. we kloneren het oxytocine receptor cDNA in een geschikt expressie systeem. Restrictie, ligase,
kloneren
- we plaatsen het cDNA in een vector: een artificieel construct waarmee vreemd DNA in een cel
kan worden gebracht (zijn vaak plasmiden). Vectoren bevatten vaak: origin of replication (kan
zichzelf vermeerderen), promotor, cloning site, genetische markers, antibioticaresistentie
(maakt selecteren handig), reporter genen, eiwit opschonings-tasks.
1
,PCR
Techniek op DNA te vermeerderen. Hier wordt TAQ polymerase voor gebruikt (doet het goed bij 70 graden).
1. hoge temperatuur (95 graden) maakt double stranded DNA open (H-bruggen breken open) in enkele
strengen DNA. DENATURATIE
2. temperatuur wordt verlaagd (55 graden) laat primers binden. ANNEALING
3. temperatuur wordt verhoogd (72 graden) waardoor TAQ polymerase bindt aan primers en bindt
nucleotiden. ELONGATIE
Dit is een cyclus, dit wordt drie aantal keer herhaald.
PCR gebruiken om een bepaalde mutatie te detecteren.
Bij grote mutatie:
- een deletie of duplicatie >50 pb
- zet je PCR product op een agarose gel
Bij kleine mutatie (SNP, insertie deletie):
- ontwikkel een selectieve primer voor de deletie/SNP. Wildtype geen PCR product. Mutant wel PCR
product (of vice versa; afhankelijk van je primer design).
- zet PCR fragmenten op een gel
Gel elektroforese
Het kleuren van DNA op een agarose gel met ethidium bromide (=kleurstof). UV licht maakt de desbetreffende
bindingen zichtbaar. DNA wordt gepipetteerd in gaatjes in de gel. Vervolgens wordt er een spanning geplaatst
over de gel (bovenkant negatief en onderkant positief). DNA is negatief geladen dus zal naar beneden worden
getrokken door de spanning. Kleine stukjes DNA zullen zich sneller door de gel verplaatsen dan de grotere
stukken.
Stappen gel elektroforese:
1. maak de gel
- hier is oa agarose en buffer (nodig voor de elektrische lading vd gel) voor nodig.
- plaats mengsel in magnetron en daarna in het gelbakje met de gel kam. Laat dan stollen.
- verwijder dan de kam, nu heb je gaatjes in de gel, waar je zo in kan pipetteren.
2. maak het gel apparaat klaar voor gebruik
- hier is een gel elektroforese box, buffer en je gemaakte gel voor nodig.
- plaats buffer in de gel elektroforese box. Haal de tape van de geld mold en plaats dan de gel in de
elektroforese box.
3. plaats de DNA sample in de gel
- hier is voor nodig: loading buffer, epje met DNA, DNA standard size en pipetten.
- pipetteer loading buffer (bevat een kleurtje, zodat je het kan zien) in het epje met DNA.
- pipetteer dan van epje DNA in de gel.
- pipetteer dan DNA standard size en plaats in het volgende gaatje in de gel.
4. plaats de spanning over de gel
- spanning aansluiten en de gel laten lopen.
5. kleur de gel en analyseer de resultaten.
- haal gel uit de gelelektroforese box.
- DNA staining solution maakt DNA fluorescent. Haal gel uit de mold en plaats in de DNA staining
solution.
- plaats na een half uur de gel in een UV machine.
- analyseer.
Je ziet alleen een bandje als je heel veel DNA van dezelfde lengte hebt (vaak wel bandje als je PCR methode
gebruikt). Gelelektroforese is een vorm van chromatografie.
2
, Restrictieenzymen
Restrictie-enzymen zijn moleculaire scharen met een specifieke ‘knip’. Restrictie-enzym knipt op een
restrictie-site: stukjes DNA die herkend worden door bepaalde enzymen die DNA knippen.
Meeste restrictie-enzymen knippen scheef.
Om ons cDNA in een expressie vector te kloneren maken we zogenaamde ‘sticky ends’. Twee methoden:
1. gebruik speciale PCR primers om aan je gekloneerde DNA ‘sticky ends’ te maken. Zie plaatje. Je hebt
je DNA (oranje) waar onze primer voor een stuk op past. We maken de primer langer. In dit extra
stukje DNA kan een restrictie-enzym knippen. Vervolgens PCR reactie waardoor je
veel van dat soort fragmenten met restrictie site krijgt. Dan knippen met
restrictie-enzym, waardoor je sequenties met sticky ends hebt.
2. ligeer adapters die de gewenste restrictie sites bevatten aan je cDNA (‘linkers’).
(ligase maakt losse stukjes DNA aan elkaar). Zie plaatje. Linkers aan je DNA
plakken, en vervolgens kan knippen. Ligatie
Nu kan het nieuwe DNA in het organisme zetten waar je het tot expressie wil brengen
(=transfectie).
Sequencing
Sequencen is het bepalen vd basenvolgorde van een gen (wat je bv wilt onderzoeken). Strategie om onbekende
mutaties in een bekend gen op te sporen. Stappen:
1. Zoek het bekende gen op in het humane genoom
2. Amplificeer het gen
- Ontwerp primers om het gen te amplificeren met PCR
- Of kloneer het gen in een bacterie (als het een heel groot gen is)
3. Bepaal de basenparen volgorden van het gen (sequencing)
- Sanger sequencing
- Beperkingen: slechte kwaliteit door primer binding
- Maar wel hele basenpaar volgorde te bepalen → kijken of er mutaties in een gen zitten
Microarray (H14, zie ook array CGH H17 (al behandeld))
Je gebruikt een soort chip (microarray) met allemaal kleine gaatjes die elk horen bij een gen, in elk gaatje zit het
stukje DNA die hoort bij een bepaald gen van het genoom. Je mengt het gekleurde cDNA van de geïnfecteerde
en niet-geïnfecteerde organismen en pipetteert dat over de microarray. De genen die tot expressie komen (“aan”
staan) binden aan de stukjes DNA op de microarray. Als je de microarray met de computer gaat bekijken kun je
aan de kleur zien welke genen tot expressie komen. Als een stipje rood gekleurd is komt dat gen tot expressie in
het geïnfecteerde organisme, als het groen gekleurd is komt het gen tot expressie in het niet-geïnfecteerde
organisme, als het gemengd is komt het in beide tot expressie en als het stipje niet gekleurd is komt het in beide
niet tot expressie.
Transgene dieren (boek)
Key concept: transgenese kan nieuw of gewijzigd genetisch materiaal in eukaryote cellen introduceren.
3
Je kunt, gebruikmakend van onderstaande technieken, strategieën formuleren om onderzoekshypotheses te
testen:
DNA extractie
1. cellen verzamelen van het test subject (bv uit wangslijmvlies).
- met wattenstaafje aan de binnenkant vd wang strijken
- plaats wattenstaafje in epje (knip de punt vh wattenstaafje eraf)
2. barst cellen open om DNA vrij te laten komen.
- pipetteer lysis buffer in het epje met het stukje wattenstaaf.
- plaats dan het epje in een warmwaterbad
- lysis buffer bestaat uit detergent (laat de cellen openbarsten waardoor het DNA vrijkomt) en enzym
proteinase K (knipt histonen eruit waardoor DNA vrijkomt)
3. scheidt het DNA van eiwitten en puin (debris).
- pipetteer geconcentreerde zoutoplossing in het epje (epje is uit het warmwaterbad). Hierdoor gaat al het
niet-DNA (zoals eiwitten) samenklonteren
- plaats epje in centrifuge. Hierdoor bevindt het samengeklonterde niet-DNA zich onderin het epje na het
centrifugeren
- pipetteer dan de bovenste (DNA) vloeistof in een nieuw epje.
4. isoleer het geconcentreerde DNA.
- pipetteer dan isopropyl alcohol in het nieuwe epje. Dit maakt het DNA zichtbaar met blote oog.
- centrifugeer het epje dan weer.
- pipetteer dan de bovenste vloeistof (alcohol?), je houdt dan het geconcentreerde DNA over.
mRNA extractie
Kan bv door: metaalballetjes waaraan polytae is vastgemaakt. Aan poltae binden de poly-a-staarten van mRNA.
Dit is een opzuiveringsstap.
cDNA productie
Voorbeeld: oxytocine receptor agonist.
Stap 1: breng humaan gen tot expressie in een ander organisme. We zijn eigenlijk alleen geïnteresseerd in het
eiwit, en dus isoleren we het mRNA (gen is onduidelijk concept; want intronen, exonen, UTR’s, promotor etc).
Hoe vinden we mRNA van een bekend gen?
1. isoleer al het mRNA uit weefsel
- kan bv door: metaalballetjes waaraan polytae is vastgemaakt. Aan poltae binden de
poly-a-staarten van mRNA. Dit is een opzuiveringsstap
2. vervolgens produceren we selectief het oxytocine receptor cDNA dmv reverse transcriptase
- RNA virussen bevatten een RNA genoom (enkel of dubbelstrengs). Retrovirussen bevatten
een RNA genoom maar produceren een DNA kopie die intercaleert in het genoom in de
gastheer (provirus). Door reverse transcriptase.
- twee opties om cDNA te produceren, zie plaatje.
- optie 1: primer gebruiken die op de poly-a-staart gaat zitten (poly-t). Je
krijgt de hele streng, geen specifiek stukje.
- optie 2: specifieke primer gebruiken. In ons geval. Je krijgt een
specifiek stukje.
- dmv reverse transcriptase kunnen we ons stukje DNA vermeerderen. En eventueel mbv PCR
het stukje heel vaak vermeerderen
3. we kloneren het oxytocine receptor cDNA in een geschikt expressie systeem. Restrictie, ligase,
kloneren
- we plaatsen het cDNA in een vector: een artificieel construct waarmee vreemd DNA in een cel
kan worden gebracht (zijn vaak plasmiden). Vectoren bevatten vaak: origin of replication (kan
zichzelf vermeerderen), promotor, cloning site, genetische markers, antibioticaresistentie
(maakt selecteren handig), reporter genen, eiwit opschonings-tasks.
1
,PCR
Techniek op DNA te vermeerderen. Hier wordt TAQ polymerase voor gebruikt (doet het goed bij 70 graden).
1. hoge temperatuur (95 graden) maakt double stranded DNA open (H-bruggen breken open) in enkele
strengen DNA. DENATURATIE
2. temperatuur wordt verlaagd (55 graden) laat primers binden. ANNEALING
3. temperatuur wordt verhoogd (72 graden) waardoor TAQ polymerase bindt aan primers en bindt
nucleotiden. ELONGATIE
Dit is een cyclus, dit wordt drie aantal keer herhaald.
PCR gebruiken om een bepaalde mutatie te detecteren.
Bij grote mutatie:
- een deletie of duplicatie >50 pb
- zet je PCR product op een agarose gel
Bij kleine mutatie (SNP, insertie deletie):
- ontwikkel een selectieve primer voor de deletie/SNP. Wildtype geen PCR product. Mutant wel PCR
product (of vice versa; afhankelijk van je primer design).
- zet PCR fragmenten op een gel
Gel elektroforese
Het kleuren van DNA op een agarose gel met ethidium bromide (=kleurstof). UV licht maakt de desbetreffende
bindingen zichtbaar. DNA wordt gepipetteerd in gaatjes in de gel. Vervolgens wordt er een spanning geplaatst
over de gel (bovenkant negatief en onderkant positief). DNA is negatief geladen dus zal naar beneden worden
getrokken door de spanning. Kleine stukjes DNA zullen zich sneller door de gel verplaatsen dan de grotere
stukken.
Stappen gel elektroforese:
1. maak de gel
- hier is oa agarose en buffer (nodig voor de elektrische lading vd gel) voor nodig.
- plaats mengsel in magnetron en daarna in het gelbakje met de gel kam. Laat dan stollen.
- verwijder dan de kam, nu heb je gaatjes in de gel, waar je zo in kan pipetteren.
2. maak het gel apparaat klaar voor gebruik
- hier is een gel elektroforese box, buffer en je gemaakte gel voor nodig.
- plaats buffer in de gel elektroforese box. Haal de tape van de geld mold en plaats dan de gel in de
elektroforese box.
3. plaats de DNA sample in de gel
- hier is voor nodig: loading buffer, epje met DNA, DNA standard size en pipetten.
- pipetteer loading buffer (bevat een kleurtje, zodat je het kan zien) in het epje met DNA.
- pipetteer dan van epje DNA in de gel.
- pipetteer dan DNA standard size en plaats in het volgende gaatje in de gel.
4. plaats de spanning over de gel
- spanning aansluiten en de gel laten lopen.
5. kleur de gel en analyseer de resultaten.
- haal gel uit de gelelektroforese box.
- DNA staining solution maakt DNA fluorescent. Haal gel uit de mold en plaats in de DNA staining
solution.
- plaats na een half uur de gel in een UV machine.
- analyseer.
Je ziet alleen een bandje als je heel veel DNA van dezelfde lengte hebt (vaak wel bandje als je PCR methode
gebruikt). Gelelektroforese is een vorm van chromatografie.
2
, Restrictieenzymen
Restrictie-enzymen zijn moleculaire scharen met een specifieke ‘knip’. Restrictie-enzym knipt op een
restrictie-site: stukjes DNA die herkend worden door bepaalde enzymen die DNA knippen.
Meeste restrictie-enzymen knippen scheef.
Om ons cDNA in een expressie vector te kloneren maken we zogenaamde ‘sticky ends’. Twee methoden:
1. gebruik speciale PCR primers om aan je gekloneerde DNA ‘sticky ends’ te maken. Zie plaatje. Je hebt
je DNA (oranje) waar onze primer voor een stuk op past. We maken de primer langer. In dit extra
stukje DNA kan een restrictie-enzym knippen. Vervolgens PCR reactie waardoor je
veel van dat soort fragmenten met restrictie site krijgt. Dan knippen met
restrictie-enzym, waardoor je sequenties met sticky ends hebt.
2. ligeer adapters die de gewenste restrictie sites bevatten aan je cDNA (‘linkers’).
(ligase maakt losse stukjes DNA aan elkaar). Zie plaatje. Linkers aan je DNA
plakken, en vervolgens kan knippen. Ligatie
Nu kan het nieuwe DNA in het organisme zetten waar je het tot expressie wil brengen
(=transfectie).
Sequencing
Sequencen is het bepalen vd basenvolgorde van een gen (wat je bv wilt onderzoeken). Strategie om onbekende
mutaties in een bekend gen op te sporen. Stappen:
1. Zoek het bekende gen op in het humane genoom
2. Amplificeer het gen
- Ontwerp primers om het gen te amplificeren met PCR
- Of kloneer het gen in een bacterie (als het een heel groot gen is)
3. Bepaal de basenparen volgorden van het gen (sequencing)
- Sanger sequencing
- Beperkingen: slechte kwaliteit door primer binding
- Maar wel hele basenpaar volgorde te bepalen → kijken of er mutaties in een gen zitten
Microarray (H14, zie ook array CGH H17 (al behandeld))
Je gebruikt een soort chip (microarray) met allemaal kleine gaatjes die elk horen bij een gen, in elk gaatje zit het
stukje DNA die hoort bij een bepaald gen van het genoom. Je mengt het gekleurde cDNA van de geïnfecteerde
en niet-geïnfecteerde organismen en pipetteert dat over de microarray. De genen die tot expressie komen (“aan”
staan) binden aan de stukjes DNA op de microarray. Als je de microarray met de computer gaat bekijken kun je
aan de kleur zien welke genen tot expressie komen. Als een stipje rood gekleurd is komt dat gen tot expressie in
het geïnfecteerde organisme, als het groen gekleurd is komt het gen tot expressie in het niet-geïnfecteerde
organisme, als het gemengd is komt het in beide tot expressie en als het stipje niet gekleurd is komt het in beide
niet tot expressie.
Transgene dieren (boek)
Key concept: transgenese kan nieuw of gewijzigd genetisch materiaal in eukaryote cellen introduceren.
3
