DNA isolatie en functie chemicaliën
lyseren- functies en chemicaliën
1. SDS- Breekt celmembranen open en denatureert eiwitten door interactie met hun
hydrofobe gebieden
2. B- mercapto- ethanol/DTT - Breekt zwavelbruggen in eiwitten, waardoor deze
volledig worden gedenatureerd en ze hun structuur verliezen
3. Proteinase K- een enzym dat eiwitten afbreekt door hydrolyse van peptidebindingen,
waardoor DNA of RNA vrijkomt uit eiwitcomplexen
4. RNAse A- Breekt RNA af om DNA- verontreinigen te voorkomen
5. Tris- HCL - houdt ph in stabiel
6. EDTA- bindt calcium en remt enzymen die DNA kunne afbreken
7. Fenol- denatureert eiwitten en verwijderd fosfolipiden
8. guanidine HCI/ Guanidine - isothiocyanaat - Denatureert eiwitten en stabiliseert
nucleïnezuren
Samenstelling van lysis buffer hangt af van het type extractie!
Vaste fase extractie
1. Guanidine HCI/ Guanidine - isothiocyanaat - verstoort de interactie van
nucleïnezuren met water
2. Chao Tropisch zout- denatureert eiwit door binding aan polaire delen van het eiwit
Organisch extractie
1. NaCl- Helpt bij het neerslaan van celresten en voorkomt dat DNA aan eiwitten bindt
2. Chloroform- zorgt voor scheiding van waterige en vetachtige stoffen, waardoor
eiwitten en vetten oplossen.
3. Isoamylalcohol- zorgt voor een duidelijke scheidingslaag en voorkomt de vorming
van giftig fosgeen
4. Isopropanol/ ethanol + natriumacetaat- Haalt water weg rond DNA, zodat het
neerslaat en kan worden teruggewonnen
Uitzouden
1. Natriumcitraat- bindt magnesiumionen, waardoor DNA- afbrekende enzymen
(DNAse) niet meer werken
2. NaCl- zorgt ervoor dat celresten neerslag en voorkomt dat DNA aan eiwitten bindt
3. Ethanol/ isopropanol- verwijdert water rond DNA, zodat het neerslaat en makkelijker
kan worden teruggewonnen
DNA extractie uit planten
1. B- mercaptoethanol- breekt eiwitten af en voorkomt dat polyfenolen en tannines DNA
beschadigen
2. PVP- verwijderen van fenolverbindingen (onder PVP→ polyfenolen binden aan DNA)
3. CTAB (kationische detergent) - eiwit denaturatie en precipiteren (uit te laten
neerslaan) van vetten en polysacharide met chloroform
4. Chloroform, fenol, isoamyl alcohol, ethanol+natriumacetaat- zelfde als hierboven
Plasmide isolatie:
, 1. Lysozyme: Lysozyme wordt toegevoegd om de bacteriële celwanden af te breken.
2. Cellyse: De cellen worden gekraakt met NaOH (dat het chromosomale DNA
denatureert) en SDS (dat de celmembranen oplost en eiwitten denatureert),
waardoor het plasmide-DNA vrijkomt.
3. Denaturatie: Het chromosomale DNA wordt gedetecteerd door de NaOH, waardoor
het oplost en het plasmide-DNA in oplossing blijft.
4. Neutralisatie: Azijnzuur wordt toegevoegd om de NaOH te neutraliseren, waardoor
het chromosomale DNA neerslaat en het plasmide-DNA in oplossing blijft.
5. Concentratie van DNA met ethanolprecipitatie: Ethanol wordt toegevoegd om het
plasmide-DNA te precipiteren (neerslaan). Na centrifugatie wordt het DNA in het
pellet geconcentreerd.
6. Zuivering: Het plasmide-DNA wordt verder gepurificeerd door het oplossen in een
buffer.
Spectrofotometer:
ratio 260/80 = 1.8 zuiver DNA
ratio 260/280= langer 1.8 is eiwitcontamintaie
ratio 260/280 = hoger 1.8 is RNA contaminatie
Agarose gelelektroforese:
- De felheid (intensiteit) zegt iets over de hoeveelheid DNA
- De positie op de gel zegt iets over de grootte van het fragment
- Beide moet je afzetten tegen een standaardwaarde, de mol marker bestaande uit
DNA fragmenten van bekende grootte.
, DNA Replicatie
Opbouw DNA:
1) Nucleotiden - De bouwstenen van DNA
- Fosfaatgroep
- Suiker
- Stikstofbasen (adenine, thymine, cytosine of guanine)
2) Dubbele helix - Twee strengen nucleotiden die in een spiraalvorm gewonden zijn en
verboden door twee waterstofbruggen tussen de basen:
- A bindt met T (2 waterstofbruggen)
- C bindt G (3 waterstofbruggen)
3) Antiparallelle richting - De ene streng loopt van 5´ naar 3´, de andere van 3´ naar 5´
4) Chromosomen - Opgerold DNA in de celkern, verpakt met eiwitten (histonen)
3 Modellen DNA replicatie:
- Conservatief: Oud DNA blijft volledig behouden.
- Semi-conservatief: Elke dochter streng krijgt 50% oud DNA.
- Dispersief: Oud en nieuw DNA zijn willekeurig gemengd
DNA- replicatie stappenplan:
1) Initiatie
- Helicase (enzym) maakt het DNA open door de waterstofbruggen tussen de base te
breken → topoisomerase voorkomt dat DNA in de knoop raakt
- Single- Strand Binding Proteins (SSB´S) zorgen ervoor dat de strengen niet terug
aan elkaar plakken
- Primase plaatst een korte RNA- primer op beide strengen als startpunt voor DNA-
polymerase
2) Elongatie
- DNA- polymerase III voegt nieuwe nucleotiden toe aan de 3´-kant van de nieuwe
streng.
- Leidende streng (leading strand); DNA- polymerase werkt niet soepel en maakt de
nieuwe streng in een keer
- Volgende streng (lagging strand); DNA- polymerase werkt in stukjes (Okazaki-
fragmenten) omdat het alleen in de 5´ → 3´ richting kan werken
3) Terminatie
- DNA- polymerase I vervangt de RNA- primers door DNA
- Ligase plakt de Okazaki- fragmenten aan elkaar
- Het DNA wordt gecontroleerd op fouten en is nu klaar
Resultaat: Twee identieke DNA- moleculen, elk met een oude en een nieuwe streng (semi-
conservatief)
lyseren- functies en chemicaliën
1. SDS- Breekt celmembranen open en denatureert eiwitten door interactie met hun
hydrofobe gebieden
2. B- mercapto- ethanol/DTT - Breekt zwavelbruggen in eiwitten, waardoor deze
volledig worden gedenatureerd en ze hun structuur verliezen
3. Proteinase K- een enzym dat eiwitten afbreekt door hydrolyse van peptidebindingen,
waardoor DNA of RNA vrijkomt uit eiwitcomplexen
4. RNAse A- Breekt RNA af om DNA- verontreinigen te voorkomen
5. Tris- HCL - houdt ph in stabiel
6. EDTA- bindt calcium en remt enzymen die DNA kunne afbreken
7. Fenol- denatureert eiwitten en verwijderd fosfolipiden
8. guanidine HCI/ Guanidine - isothiocyanaat - Denatureert eiwitten en stabiliseert
nucleïnezuren
Samenstelling van lysis buffer hangt af van het type extractie!
Vaste fase extractie
1. Guanidine HCI/ Guanidine - isothiocyanaat - verstoort de interactie van
nucleïnezuren met water
2. Chao Tropisch zout- denatureert eiwit door binding aan polaire delen van het eiwit
Organisch extractie
1. NaCl- Helpt bij het neerslaan van celresten en voorkomt dat DNA aan eiwitten bindt
2. Chloroform- zorgt voor scheiding van waterige en vetachtige stoffen, waardoor
eiwitten en vetten oplossen.
3. Isoamylalcohol- zorgt voor een duidelijke scheidingslaag en voorkomt de vorming
van giftig fosgeen
4. Isopropanol/ ethanol + natriumacetaat- Haalt water weg rond DNA, zodat het
neerslaat en kan worden teruggewonnen
Uitzouden
1. Natriumcitraat- bindt magnesiumionen, waardoor DNA- afbrekende enzymen
(DNAse) niet meer werken
2. NaCl- zorgt ervoor dat celresten neerslag en voorkomt dat DNA aan eiwitten bindt
3. Ethanol/ isopropanol- verwijdert water rond DNA, zodat het neerslaat en makkelijker
kan worden teruggewonnen
DNA extractie uit planten
1. B- mercaptoethanol- breekt eiwitten af en voorkomt dat polyfenolen en tannines DNA
beschadigen
2. PVP- verwijderen van fenolverbindingen (onder PVP→ polyfenolen binden aan DNA)
3. CTAB (kationische detergent) - eiwit denaturatie en precipiteren (uit te laten
neerslaan) van vetten en polysacharide met chloroform
4. Chloroform, fenol, isoamyl alcohol, ethanol+natriumacetaat- zelfde als hierboven
Plasmide isolatie:
, 1. Lysozyme: Lysozyme wordt toegevoegd om de bacteriële celwanden af te breken.
2. Cellyse: De cellen worden gekraakt met NaOH (dat het chromosomale DNA
denatureert) en SDS (dat de celmembranen oplost en eiwitten denatureert),
waardoor het plasmide-DNA vrijkomt.
3. Denaturatie: Het chromosomale DNA wordt gedetecteerd door de NaOH, waardoor
het oplost en het plasmide-DNA in oplossing blijft.
4. Neutralisatie: Azijnzuur wordt toegevoegd om de NaOH te neutraliseren, waardoor
het chromosomale DNA neerslaat en het plasmide-DNA in oplossing blijft.
5. Concentratie van DNA met ethanolprecipitatie: Ethanol wordt toegevoegd om het
plasmide-DNA te precipiteren (neerslaan). Na centrifugatie wordt het DNA in het
pellet geconcentreerd.
6. Zuivering: Het plasmide-DNA wordt verder gepurificeerd door het oplossen in een
buffer.
Spectrofotometer:
ratio 260/80 = 1.8 zuiver DNA
ratio 260/280= langer 1.8 is eiwitcontamintaie
ratio 260/280 = hoger 1.8 is RNA contaminatie
Agarose gelelektroforese:
- De felheid (intensiteit) zegt iets over de hoeveelheid DNA
- De positie op de gel zegt iets over de grootte van het fragment
- Beide moet je afzetten tegen een standaardwaarde, de mol marker bestaande uit
DNA fragmenten van bekende grootte.
, DNA Replicatie
Opbouw DNA:
1) Nucleotiden - De bouwstenen van DNA
- Fosfaatgroep
- Suiker
- Stikstofbasen (adenine, thymine, cytosine of guanine)
2) Dubbele helix - Twee strengen nucleotiden die in een spiraalvorm gewonden zijn en
verboden door twee waterstofbruggen tussen de basen:
- A bindt met T (2 waterstofbruggen)
- C bindt G (3 waterstofbruggen)
3) Antiparallelle richting - De ene streng loopt van 5´ naar 3´, de andere van 3´ naar 5´
4) Chromosomen - Opgerold DNA in de celkern, verpakt met eiwitten (histonen)
3 Modellen DNA replicatie:
- Conservatief: Oud DNA blijft volledig behouden.
- Semi-conservatief: Elke dochter streng krijgt 50% oud DNA.
- Dispersief: Oud en nieuw DNA zijn willekeurig gemengd
DNA- replicatie stappenplan:
1) Initiatie
- Helicase (enzym) maakt het DNA open door de waterstofbruggen tussen de base te
breken → topoisomerase voorkomt dat DNA in de knoop raakt
- Single- Strand Binding Proteins (SSB´S) zorgen ervoor dat de strengen niet terug
aan elkaar plakken
- Primase plaatst een korte RNA- primer op beide strengen als startpunt voor DNA-
polymerase
2) Elongatie
- DNA- polymerase III voegt nieuwe nucleotiden toe aan de 3´-kant van de nieuwe
streng.
- Leidende streng (leading strand); DNA- polymerase werkt niet soepel en maakt de
nieuwe streng in een keer
- Volgende streng (lagging strand); DNA- polymerase werkt in stukjes (Okazaki-
fragmenten) omdat het alleen in de 5´ → 3´ richting kan werken
3) Terminatie
- DNA- polymerase I vervangt de RNA- primers door DNA
- Ligase plakt de Okazaki- fragmenten aan elkaar
- Het DNA wordt gecontroleerd op fouten en is nu klaar
Resultaat: Twee identieke DNA- moleculen, elk met een oude en een nieuwe streng (semi-
conservatief)
