Moleculaire biologie 1
→ een gebied in de wetenschap die de structuur van cellen op moleculair niveau onderzoekt
CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
→ snelle, makkelijke en goedkope techniek met meerdere doeleinden. Deze techniek kan
elke sequentie targetten, meerdere sequenties binnen een enkele cel targetten (multiplex)
en gebruikt worden in verschillende organismen
- Onderzoekers hopen dit systeem te gebruiken om menselijke genen aan te passen
om ziekten te elimineren, sterkere planten te creëren, ziekteverwekkers uit te roeien
en nog veel meer.
Gebaseerd op het adaptieve immuunsysteem van bacteriën (prokaryoten)
- Bacteriën hebben in hun DNA vele repeats zitten → CRISPR gebieden
- Repeats blijken achteraf niet interessant
- Tussen de repeats liggen spacers → stukjes DNA afkomstig van bacteriofagen (of
andere virussen) die ingebouwd zijn in het DNA van bacteriën
- Dienen als geheugen
Hoe werkt dit afweersysteem?
1. Een bacteriofaag infecteert een bacterie en brengt zijn DNA in
a. Dit DNA zal zich integreren en repliceren in de bacterie om nieuwe
viruspartikels te vormen en zich te verspreiden
2. Cas eiwitten knippen een stukje dsDNA (protospacer) van de bacteriofaag en dit
stukje wordt ingebouwd in de CRISPR regio van de bacterie
a. Het stukje dsDNA dat geknipt wordt ligt altijd naast een PAM sequentie
i. Korte DNA sequentie (2-6 bp)
ii. NGG of NAG (N kan hier elke nucleotide zijn)
iii. De PAM sequentie moet downstream het doel-DNA liggen
3. Bij een tweede infectie door eenzelfde bacteriofaag wordt het CRISPR gebied
afgeschreven tot RNA, crisprRNA (crRNA)
4. Het crRNA komt samen met het Cas9 eiwit en tracerRNA (tracrRNA)
5. Er wordt een complementair stukje dsDNA gevonden aan het RNA
6. Cas9 knipt het dsDNA van de bacteriofaag kapot
a. Cas9 moet hiervoor de complementaire sequentie
herkennen maar ook de PAM sequentie
i. Herkenning van de PAM sequentie zorgt
ervoor dat Cas9 eiwitten geen eigen DNA
kapot knipt (eigen DNA bevat geen PAM
sequenties)
Dit systeem kan ook gebruikt worden voor een knock out van genen. Hiervoor moet in de cel
worden gebracht
- Cas9 → knipt DNA
- TracrRNA → activeert Cas9 om te binden aan het target DNA (protospacer)
- Let op: voor deze binding van Cas9 is een PAM sequentie noodzakelijk
1
, - SpacerRNA = crRNA → gebaseerd op het gen waarvoor je een knock-out wilt
ontwerpen
- Moet homoloog zijn aan het te knippen DNA
- Deze homologe sequentie moet upstream een PAM sequentie liggen
→ er kan ook een combinatie van crRNA en tracrRNA worden ingebracht →
single-gideRNA (sgRNA)
→ door het knippen van Cas9 ontstaat een breuk in het DNA, deze breuk kan op
verschillende manieren worden hersteld:
1. Non-homologous end joining (NHEJ) → meest voorkomend
a. Knip in het DNA wordt herkent en gerepareerd, met fouten (a)
i. Hierbij ontstaan inserties en deleties (indels)
ii. Dit zorgt ervoor dat het DNA niet meer afgeschreven kan
worden → knock out (door bijvoorbeeld een frameshift)
b. Door een stukje DNA te introduceren kan dit worden ingebouwd op de
plek van de knip → gene insertion/indels (b)
2. Homologous recombination (HR)
a. Bij bepaalde stadia liggen homologe chromosomen bij elkaar en gaan
recombineren (c)
i. Hierbij ontstaat een perfecte recombinatie
b. Door een stukje DNA te introduceren kan dit worden ingebouwd op de
plek van de knip (d)
i. Dit kan heel precies, op een enkele nucleotide nauwkeurig
Een knock out wordt vaak uitgevoerd aan het begin van een gen (of zelfs in de promotor)
- Hoe later in het gen de modificatie hoe groter de kans dat er een (nog deels)
actief/productief eiwit ontstaat
- De efficiëntie van een knock out kan worden verbeterd door meerdere sgRNA's te
gebruiken om tegelijkertijd op hetzelfde gen te richten
- Knock out in planten is moeilijk doordat deze vele kopieën bevatten van hetzelfde
gen (polyploid)
Nadelen van het CRISPR Cas systeem → stray edits. Om dit te voorkomen zijn
verschillende manieren:
1. Cas9 knipt slechts in een enkele streng (a)
a. 2 Cas9 eiwitten nodig
b. Door 2 knipjes bij elkaar zal een dubbelstrengs break ontstaan
2
, 2. Beide knipgebieden* worden uitgeschakeld (b)
a. 2 sgRNA die vlak bij elkaar liggen kunnen
binden aan het Fok1 gebied
b. Zijn beide gebonden ontstaat er een
dubbelstrengs knip
3. Verlengen van het sgRNA waardoor deze
specifieker is (c)
4. Ontwikkelen van Cas9-eiwitten die langere PAM
sequenties nodig hebben die minder vaak in het
genoom voorkomen
→ stray edits ontstaan ook doordat DNA sequenties met
een insertie of deletie het CRISPR-Cas9 systeem
induceren → dit zorgt ervoor dat ook virussen met
puntmutaties het systeem niet kunnen ontwijken
*Knipgebieden
- Het Cas9 eiwit bevat twee plekken waar geknipt gaat worden
1. RuvC → knipt tegenovergestelde streng (tegenovergestelde streng dan waar
sgRNA gebonden is)
2. HNH → knipt eigen streng (waar sgRNA gebonden is)
CRISPRi dCas9
- dCas9 = dead Cas9
- Gebrek aan endonuclease activiteit door puntmutaties in de RuvC en HNH
nuclease domeinen
- Kan verschillende regulerende functies vertonen:
- Binden aan de non template (coding) strand zorgt voor blokkade van
de transcriptie (wegversperring voor RNA polymerase)
- Binden aan de RNA polymerase bindingsplek op de template of non
template strand zorgt voor het remmen van de transcriptie-initiatie
- Het CRISPRi dCas9 systeem kent beperkingen:
1. De vereiste PAM sequentie beperkt de beschikbare target plekken in het
genoom
2. De targeting-specificiteit wordt bepaald door het sgRNA die ook een off-target
effect kan veroorzaken in organismen met grote genomen (stray edits)
3. Het niveau van transcriptionele repressie in zoogdiercellen tussen genen
varieert
Gene drive
→ met behulp van CRISPR Cas9 wordt het Cas9 eiwit en sgRNA ingebouwd in een
chromosoom, door HR wordt het homologe chromosoom ook aangepast:
1. Een dsDNA breuk wordt gemaakt met een CRISPR Cas9
2. Via HR wordt de breuk gerepareerd en wordt het Cas9 gen en sgRNA geïntegreerd
- Hierbij wordt dus ook een stukje extra DNA, met Cas9 een sgRNA
aangebracht (zie figuur (d) op pagina 2)
3
, 3. Het tweede chromosoom wordt nu direct (door aanwezigheid van sgRNA) geknipt en
via HR met het eerste chromosoom gerepareerd
→ beide chromosomen zijn nu identiek en beschikken over Cas9 en sgRNA
4. Tijdens paring zullen ook de chromosomen afkomstig van het andere organisme
geknipt worden en gerepareerd met HR (en dus wordt Cas9 en sgRNA ook hier
ingebouwd
→ op deze manier kunnen er hele populaties worden aangepast
- Bijvoorbeeld malaria kan hierdoor uit de mosquito's worden geknipt (maar
veel ethische consequenties…)
Toepassingen van het CRISPR-CAS9 systeem
- Genomen bewerkingen in planten om de prestaties van gewassen te verbeteren
- Gunstig omdat meerdere plant-eigenschappen tegelijk kunnen worden
gewijzigd
- Regulatie en functies van genen onderzoeken
- dCas9 is niet in staat om DNA te knippen maar nog wel te binden waardoor
genexpressie gereguleerd kan worden
- Binding van dCas9 blokkeert de transcriptie initiatie en verlenging
- Verschillende sgRNA’s die zich richten op verschillende promotors maken het
mogelijk verschillende genen tegelijk te reguleren
- Visualiseren van verschillende loci op het genoom (voor bijvoorbeeld het bestuderen
van chromosoom structuur en dynamica)
- dCas9 gefuceerd met een flourescerend eiwit (GFP)
- Targetten van eiwitten die betrokken zijn bij histonen modificatie en DNA methylatie
4
→ een gebied in de wetenschap die de structuur van cellen op moleculair niveau onderzoekt
CRISPR-Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)
→ snelle, makkelijke en goedkope techniek met meerdere doeleinden. Deze techniek kan
elke sequentie targetten, meerdere sequenties binnen een enkele cel targetten (multiplex)
en gebruikt worden in verschillende organismen
- Onderzoekers hopen dit systeem te gebruiken om menselijke genen aan te passen
om ziekten te elimineren, sterkere planten te creëren, ziekteverwekkers uit te roeien
en nog veel meer.
Gebaseerd op het adaptieve immuunsysteem van bacteriën (prokaryoten)
- Bacteriën hebben in hun DNA vele repeats zitten → CRISPR gebieden
- Repeats blijken achteraf niet interessant
- Tussen de repeats liggen spacers → stukjes DNA afkomstig van bacteriofagen (of
andere virussen) die ingebouwd zijn in het DNA van bacteriën
- Dienen als geheugen
Hoe werkt dit afweersysteem?
1. Een bacteriofaag infecteert een bacterie en brengt zijn DNA in
a. Dit DNA zal zich integreren en repliceren in de bacterie om nieuwe
viruspartikels te vormen en zich te verspreiden
2. Cas eiwitten knippen een stukje dsDNA (protospacer) van de bacteriofaag en dit
stukje wordt ingebouwd in de CRISPR regio van de bacterie
a. Het stukje dsDNA dat geknipt wordt ligt altijd naast een PAM sequentie
i. Korte DNA sequentie (2-6 bp)
ii. NGG of NAG (N kan hier elke nucleotide zijn)
iii. De PAM sequentie moet downstream het doel-DNA liggen
3. Bij een tweede infectie door eenzelfde bacteriofaag wordt het CRISPR gebied
afgeschreven tot RNA, crisprRNA (crRNA)
4. Het crRNA komt samen met het Cas9 eiwit en tracerRNA (tracrRNA)
5. Er wordt een complementair stukje dsDNA gevonden aan het RNA
6. Cas9 knipt het dsDNA van de bacteriofaag kapot
a. Cas9 moet hiervoor de complementaire sequentie
herkennen maar ook de PAM sequentie
i. Herkenning van de PAM sequentie zorgt
ervoor dat Cas9 eiwitten geen eigen DNA
kapot knipt (eigen DNA bevat geen PAM
sequenties)
Dit systeem kan ook gebruikt worden voor een knock out van genen. Hiervoor moet in de cel
worden gebracht
- Cas9 → knipt DNA
- TracrRNA → activeert Cas9 om te binden aan het target DNA (protospacer)
- Let op: voor deze binding van Cas9 is een PAM sequentie noodzakelijk
1
, - SpacerRNA = crRNA → gebaseerd op het gen waarvoor je een knock-out wilt
ontwerpen
- Moet homoloog zijn aan het te knippen DNA
- Deze homologe sequentie moet upstream een PAM sequentie liggen
→ er kan ook een combinatie van crRNA en tracrRNA worden ingebracht →
single-gideRNA (sgRNA)
→ door het knippen van Cas9 ontstaat een breuk in het DNA, deze breuk kan op
verschillende manieren worden hersteld:
1. Non-homologous end joining (NHEJ) → meest voorkomend
a. Knip in het DNA wordt herkent en gerepareerd, met fouten (a)
i. Hierbij ontstaan inserties en deleties (indels)
ii. Dit zorgt ervoor dat het DNA niet meer afgeschreven kan
worden → knock out (door bijvoorbeeld een frameshift)
b. Door een stukje DNA te introduceren kan dit worden ingebouwd op de
plek van de knip → gene insertion/indels (b)
2. Homologous recombination (HR)
a. Bij bepaalde stadia liggen homologe chromosomen bij elkaar en gaan
recombineren (c)
i. Hierbij ontstaat een perfecte recombinatie
b. Door een stukje DNA te introduceren kan dit worden ingebouwd op de
plek van de knip (d)
i. Dit kan heel precies, op een enkele nucleotide nauwkeurig
Een knock out wordt vaak uitgevoerd aan het begin van een gen (of zelfs in de promotor)
- Hoe later in het gen de modificatie hoe groter de kans dat er een (nog deels)
actief/productief eiwit ontstaat
- De efficiëntie van een knock out kan worden verbeterd door meerdere sgRNA's te
gebruiken om tegelijkertijd op hetzelfde gen te richten
- Knock out in planten is moeilijk doordat deze vele kopieën bevatten van hetzelfde
gen (polyploid)
Nadelen van het CRISPR Cas systeem → stray edits. Om dit te voorkomen zijn
verschillende manieren:
1. Cas9 knipt slechts in een enkele streng (a)
a. 2 Cas9 eiwitten nodig
b. Door 2 knipjes bij elkaar zal een dubbelstrengs break ontstaan
2
, 2. Beide knipgebieden* worden uitgeschakeld (b)
a. 2 sgRNA die vlak bij elkaar liggen kunnen
binden aan het Fok1 gebied
b. Zijn beide gebonden ontstaat er een
dubbelstrengs knip
3. Verlengen van het sgRNA waardoor deze
specifieker is (c)
4. Ontwikkelen van Cas9-eiwitten die langere PAM
sequenties nodig hebben die minder vaak in het
genoom voorkomen
→ stray edits ontstaan ook doordat DNA sequenties met
een insertie of deletie het CRISPR-Cas9 systeem
induceren → dit zorgt ervoor dat ook virussen met
puntmutaties het systeem niet kunnen ontwijken
*Knipgebieden
- Het Cas9 eiwit bevat twee plekken waar geknipt gaat worden
1. RuvC → knipt tegenovergestelde streng (tegenovergestelde streng dan waar
sgRNA gebonden is)
2. HNH → knipt eigen streng (waar sgRNA gebonden is)
CRISPRi dCas9
- dCas9 = dead Cas9
- Gebrek aan endonuclease activiteit door puntmutaties in de RuvC en HNH
nuclease domeinen
- Kan verschillende regulerende functies vertonen:
- Binden aan de non template (coding) strand zorgt voor blokkade van
de transcriptie (wegversperring voor RNA polymerase)
- Binden aan de RNA polymerase bindingsplek op de template of non
template strand zorgt voor het remmen van de transcriptie-initiatie
- Het CRISPRi dCas9 systeem kent beperkingen:
1. De vereiste PAM sequentie beperkt de beschikbare target plekken in het
genoom
2. De targeting-specificiteit wordt bepaald door het sgRNA die ook een off-target
effect kan veroorzaken in organismen met grote genomen (stray edits)
3. Het niveau van transcriptionele repressie in zoogdiercellen tussen genen
varieert
Gene drive
→ met behulp van CRISPR Cas9 wordt het Cas9 eiwit en sgRNA ingebouwd in een
chromosoom, door HR wordt het homologe chromosoom ook aangepast:
1. Een dsDNA breuk wordt gemaakt met een CRISPR Cas9
2. Via HR wordt de breuk gerepareerd en wordt het Cas9 gen en sgRNA geïntegreerd
- Hierbij wordt dus ook een stukje extra DNA, met Cas9 een sgRNA
aangebracht (zie figuur (d) op pagina 2)
3
, 3. Het tweede chromosoom wordt nu direct (door aanwezigheid van sgRNA) geknipt en
via HR met het eerste chromosoom gerepareerd
→ beide chromosomen zijn nu identiek en beschikken over Cas9 en sgRNA
4. Tijdens paring zullen ook de chromosomen afkomstig van het andere organisme
geknipt worden en gerepareerd met HR (en dus wordt Cas9 en sgRNA ook hier
ingebouwd
→ op deze manier kunnen er hele populaties worden aangepast
- Bijvoorbeeld malaria kan hierdoor uit de mosquito's worden geknipt (maar
veel ethische consequenties…)
Toepassingen van het CRISPR-CAS9 systeem
- Genomen bewerkingen in planten om de prestaties van gewassen te verbeteren
- Gunstig omdat meerdere plant-eigenschappen tegelijk kunnen worden
gewijzigd
- Regulatie en functies van genen onderzoeken
- dCas9 is niet in staat om DNA te knippen maar nog wel te binden waardoor
genexpressie gereguleerd kan worden
- Binding van dCas9 blokkeert de transcriptie initiatie en verlenging
- Verschillende sgRNA’s die zich richten op verschillende promotors maken het
mogelijk verschillende genen tegelijk te reguleren
- Visualiseren van verschillende loci op het genoom (voor bijvoorbeeld het bestuderen
van chromosoom structuur en dynamica)
- dCas9 gefuceerd met een flourescerend eiwit (GFP)
- Targetten van eiwitten die betrokken zijn bij histonen modificatie en DNA methylatie
4
