MBE Meetrapport Eiwitchromatografie met AKTA
Doel Eiwitchromatografie met AKTA
Door middel van eiwitchromotografie kunnen eiwitten meer gezuiverd worden zodat ze
gescheiden zijn van andere soorten eiwitten op basis van affiniteit. Voor ons onderzoek
wilden we het eiwit tyrosinase zuiveren. Hiervoor was bij ons experiment de positief geladen
DEAE kolom gebruikt. We zullen hierbij eiwitten met een positieve lading scheiden van
eiwitten met een negatieve lading. Ons doel is om het eiwit tyrosinase te zuiveren maar
omdat we maar 1 zuiveringsstap uitvoeren zal het niet compleet zuiver zijn.
Verwachting Eiwitchromatografie met AKTA
Afb. 1 globale voorbeeld afbeelding van onze verwachtingen voor de AKTA
Tyrosinase zal zich in de tweede piek bevinden en dus in een van de latere fracties. In een van deze
fracties verwachten we dus dat de tyrosinase activiteit het hoogste is
Resultaten Eiwitchromatografie met AKTA
,Afb 2. Zuivering van eiwitten op basis van affiniteit met een DEAE kolom.
Rode lijn = zoutconcentratie
Groene lijn = de buffer switch
Blauwe lijn = UV-licht, bepaalde aminozuren absorberen UV-licht bij 280nm, dit is een maat
voor hoeveel eiwit aanwezig is
Buffer A = bevat geen zout
Buffer B = 1 molair zout
Afb 3. gemeten waarden bij 475 nm met L-DOPA. Delta A (enzymactiviteit) en metingen bij 280 nm
weergegeven. Normalisatie vergeleken met 280 nm waarden aangegeven.
Afb. 4 Tyrosinase activiteit ÄKTA met de Delta A waardes van elke uitgekozen fractie uit de
kolomgrafiek.
, Afb. 5 Genormaliseerde Delta A waardes voor elke uitgekozen fractie van kolomgrafiek. (Delta A /
A280)
Conclusie Eiwitchromatografie met AKTA
Zoals verwacht is de enzymactiviteit hoger bij de fracties met een hogere Tyrosinase
concentratie. Net nadat de buffer B toegevoegd is, is de elutie begonnen, dit was fractie 12.
Deze heeft de hoogste enzymactiviteit gehad na normalisatie.
Het doel bij deze proef was om Tyrosinase zoveel mogelijk te scheiden van de andere,
positief geladen eiwitten. De fractie met de hoogste Tyrosinase activiteit is fractie 12,
hierdoor is tyrosinase een stuk zuiverder geworden dan eerst. Om te achterhalen hoeveel
zuiverder fractie 12 dan de andere fracties is, wordt de normalisatie meting van fractie 12
gedeeld door de normalisatie meting van de ongezuiverde fractie.
0,560/0,117=4,7863
Fractie 12 is hiermee 4,79x zuiverder dan de ongezuiverde fractie.
Doel Eiwitchromatografie met AKTA
Door middel van eiwitchromotografie kunnen eiwitten meer gezuiverd worden zodat ze
gescheiden zijn van andere soorten eiwitten op basis van affiniteit. Voor ons onderzoek
wilden we het eiwit tyrosinase zuiveren. Hiervoor was bij ons experiment de positief geladen
DEAE kolom gebruikt. We zullen hierbij eiwitten met een positieve lading scheiden van
eiwitten met een negatieve lading. Ons doel is om het eiwit tyrosinase te zuiveren maar
omdat we maar 1 zuiveringsstap uitvoeren zal het niet compleet zuiver zijn.
Verwachting Eiwitchromatografie met AKTA
Afb. 1 globale voorbeeld afbeelding van onze verwachtingen voor de AKTA
Tyrosinase zal zich in de tweede piek bevinden en dus in een van de latere fracties. In een van deze
fracties verwachten we dus dat de tyrosinase activiteit het hoogste is
Resultaten Eiwitchromatografie met AKTA
,Afb 2. Zuivering van eiwitten op basis van affiniteit met een DEAE kolom.
Rode lijn = zoutconcentratie
Groene lijn = de buffer switch
Blauwe lijn = UV-licht, bepaalde aminozuren absorberen UV-licht bij 280nm, dit is een maat
voor hoeveel eiwit aanwezig is
Buffer A = bevat geen zout
Buffer B = 1 molair zout
Afb 3. gemeten waarden bij 475 nm met L-DOPA. Delta A (enzymactiviteit) en metingen bij 280 nm
weergegeven. Normalisatie vergeleken met 280 nm waarden aangegeven.
Afb. 4 Tyrosinase activiteit ÄKTA met de Delta A waardes van elke uitgekozen fractie uit de
kolomgrafiek.
, Afb. 5 Genormaliseerde Delta A waardes voor elke uitgekozen fractie van kolomgrafiek. (Delta A /
A280)
Conclusie Eiwitchromatografie met AKTA
Zoals verwacht is de enzymactiviteit hoger bij de fracties met een hogere Tyrosinase
concentratie. Net nadat de buffer B toegevoegd is, is de elutie begonnen, dit was fractie 12.
Deze heeft de hoogste enzymactiviteit gehad na normalisatie.
Het doel bij deze proef was om Tyrosinase zoveel mogelijk te scheiden van de andere,
positief geladen eiwitten. De fractie met de hoogste Tyrosinase activiteit is fractie 12,
hierdoor is tyrosinase een stuk zuiverder geworden dan eerst. Om te achterhalen hoeveel
zuiverder fractie 12 dan de andere fracties is, wordt de normalisatie meting van fractie 12
gedeeld door de normalisatie meting van de ongezuiverde fractie.
0,560/0,117=4,7863
Fractie 12 is hiermee 4,79x zuiverder dan de ongezuiverde fractie.
