Samenvatting Microscopie
Lichtmicroscopie (LM)
Lichtmicroscopie: gebruikt zichtbaar licht (400 tot 750 nm) om een vergoot beeld te produceren. De
resolutie hiervan is beperkt tot ongeveer de helft van de gebruikte golflengte, wat neerkomt op
ongeveer 250 nm (0,2 µm)
Licht bestaat uit discrete eenheden, fotonen (quanta), die de eigenschappen van zowel deeltjes als
golven bezitten.
Golflengte (λ): golflengte bepaalt de kleur. Zichtbaar licht beslaat een klein deel van het
totale spectrum, met golflengtes tussen ongeveer 400 en 750 nanometer.
Energie: de energie (E) van een foton is omgekeerd evenredig met de golflengte. Kortere
golflengten (zoals blauw licht) zijn energieker en kunnen cel schade veroorzaken.
Amplitude en Intensiteit: de helderheid van een lichtgolf wordt optisch beschreven door de
amplitude (A) van de elektrische (E) vector. De lichtintensiteit (I), die wordt gemeten door
camera's of het oog, is evenredig met het kwadraat van de amplitude (I ∝ A^2) en is altijd
positief.
Het menselijk oog-hersen-systeem detecteert lichtintensiteit en golflengte (kleur), maar kan geen
verschillen in fase of polarisatietoestand waarnemen. Om een object zichtbaar te maken, moet het
contrast vertonen ten opzichte van de achtergrond.
Interactie van licht met materialen:
Transmissie: licht dat door een specimen heen gaat en door het objectief wordt opgevangen,
heet doorgelaten licht. Als het niet wordt geabsorbeerd of afgebogen, blijft het onzichtbaar.
De brekingsindex (n) bepaalt hoe snel licht zich voortplant en hoeveel licht wordt
doorgelaten.
Reflectie: licht dat wordt teruggekaatst door een oppervlak volgt de wet dat invalshoek =
terugkaatsingshoek. Bij diffuse reflectie wordt licht in alle richtingen verstrooid.
Refractie (lichtbreking): het buigen van lichtstralen wanneer zij door het grensvlak tussen
twee media (met verschillende brekingsindices) gaan, wat wordt veroorzaakt door een
verandering in de lichtsnelheid. Dit fenomeen wordt beschreven door de Wet van Snellius en
is de basis van hoe lenzen werken.
Absorptie: Licht kan worden opgenomen door atomen of moleculen, waardoor elektronen
naar een hogere energietoestand gaan (excitatie). Gekleurde of donkere cellen absorberen
bepaalde golflengten of zelfs al het licht. Pigmentkleuren werken volgens dit principe: ze
halen specifieke golflengten uit wit licht.
Diffractie (Verstrooiing): het uitspreiden van licht dat optreedt wanneer een lichtbundel
interageert met een object waarvan de afmetingen vergelijkbaar zijn met de golflengte van
het licht. Diffractie van licht door kleine structurele elementen in het preparaat is het
voornaamste proces dat de beeldvorming in de lichtmicroscoop bepaalt.
Scattering: licht wordt in verschillende richtingen verspreid wanneer een object het licht
absorbeert en opnieuw uitzendt. Dit vermindert bijvoorbeeld het contrast in de retina, waar
vooral blauw licht sterk wordt verstrooid.
,De beeldvorming in een microscoop berust op drie interacties tussen licht en het preparaat:
1. Refractie (lichtbreking)
2. Diffractie (Verstrooiing)
3. Interferentie (Recombinatie): De recombinatie en sommatie van twee of meer lichtgolven.
Dit proces is verantwoordelijk voor het creëren van het reële beeld in de microscoop.
Constructieve interferentie verhoogt de amplitude (heldere plek); destructieve interferentie
verlaagt de amplitude (donkere plek).
Ray Tracing (stralentracing): een methode uit de geometrische optica om te bepalen waar een lens
een beeld vormt. Licht wordt hierbij voorgesteld als rechte stralen die kunnen worden gebroken of
gereflecteerd.
1. Een straal door het midden van de lens wordt niet afgebogen.
2. Een straal parallel aan de optische as gaat na de lens door het brandpunt (F).
3. Een straal die naar het brandpunt gaat, verlaat de lens parallel aan de optische as.\
Staafjes (rods): vormen ongeveer 95% van de fotoreceptoren in de retina en zijn gespecialiseerd in
nachtzicht (scotopisch zicht). Ze zijn extreem lichtgevoelig, ongeveer veertig keer gevoeliger dan
kegeltjes, en werken vooral in donkere omstandigheden. Staafjes nemen geen kleuren waar en
reageren het sterkst op licht rond 510 nm (blauwgroen). Hun belangrijkste pigment is rhodopsine.
Kegeltjes (cones): maken de overige 5% uit en zijn essentieel voor daglichtzicht, kleurwaarneming en
hoge visuele scherpte. Ze zitten voornamelijk in de fovea, waar hun dichte plaatsing de hoge
resolutie van het menselijk zicht mogelijk maakt. Er zijn drie typen kegeltjes (rood-, groen- en
blauwgevoelig), die samen kleur zien mogelijk maken via een tristimulus- (RGB) systeem. De
gevoeligheid voor blauw licht is lager doordat er weinig blauwe kegeltjes zijn en blauw licht sterk
verstrooid wordt in het oog. Groen licht wordt nauwkeuriger waargenomen omdat het zowel groene
als rode kegeltjes activeert.
Resolutie: geeft aan hoe dicht twee punten bij elkaar kunnen liggen, zodat je ze nog steeds als twee
afzonderlijke punten kunt waarnemen. Een hoge resolutie betekent een kleinere afstand die je kunt
onderscheiden.
Point spread function (PSF) = de wiskundige en optische beschrijving van de manier waarop een
optisch systeem (de lens) een enkel punt van licht (een puntbron) verspreidt en afbeeldt.
, De PSF correleert direct met de resolutie van de microscoop. Hoe breder de PSF (de wazige
plek), hoe slechter de resolutie, omdat de vlekken van twee dichtbijgelegen objecten dan
overlappen en u ze niet als afzonderlijke punten kunt onderscheiden.
Ongeacht hoe klein een object is, elk punt dat wordt afgebeeld, wordt verspreid tot een
wazige vlek, de zogenaamde Point Spread Function (PSF). In een ideale lens ziet deze vlek
eruit als een Airy-schijf.
Geen enkel lenzensysteem kan deze vlek tot één enkel punt reduceren; deze vlek is de
diffractielimiet van het optische systeem.
Airy disc = de ideale vorm van de PSF wanneer je een perfect gecorrigeerde lens gebruikt. Dit Airy-
patroon (vernoemd naar Sir George Airy) bestaat uit een heldere centrale vlek (de 0e orde
diffractievlek) omgeven door een reeks concentrische diffractieringen (1e, 2e, 3e orde, enz.).
De ringen en de vlek ontstaan door interferentie (de recombinatie) van het licht dat door de
lens is gegaan. Lichtgolven die door het midden en de rand van de lens reizen, komen exact
in fase aan in het beeldpunt (P') om de heldere vlek te creëren (constructieve interferentie).
Op punten daarnaast (P'') komen de golven uit fase aan, wat leidt tot de donkere ringen
(destructieve interferentie).
De straal (d) van deze diffractievlek is omgekeerd evenredig met de Numerieke Apertuur
(NA) en evenredig met de golflengte (λ) van het gebruikte licht.
λ
o d∝
NA
o Kleinere golflengte (bijvoorbeeld blauw licht) = een hogere resolutie.
o Grotere NA (bijvoorbeeld door olie-immersie) = een hogere resolutie.
NA (Numerieke Apertuur) = een maat voor het lichtverzamelend vermogen van het objectief. Een
hogere NA zorgt voor een kleinere diffractievlek en dus een hogere resolutie.
Brekingsindex (n) = een fundamentele optische eigenschap van een materiaal en definieert de mate
waarin licht buigt wanneer het van het ene medium naar het andere gaat (het fenomeen breking of
Lichtmicroscopie (LM)
Lichtmicroscopie: gebruikt zichtbaar licht (400 tot 750 nm) om een vergoot beeld te produceren. De
resolutie hiervan is beperkt tot ongeveer de helft van de gebruikte golflengte, wat neerkomt op
ongeveer 250 nm (0,2 µm)
Licht bestaat uit discrete eenheden, fotonen (quanta), die de eigenschappen van zowel deeltjes als
golven bezitten.
Golflengte (λ): golflengte bepaalt de kleur. Zichtbaar licht beslaat een klein deel van het
totale spectrum, met golflengtes tussen ongeveer 400 en 750 nanometer.
Energie: de energie (E) van een foton is omgekeerd evenredig met de golflengte. Kortere
golflengten (zoals blauw licht) zijn energieker en kunnen cel schade veroorzaken.
Amplitude en Intensiteit: de helderheid van een lichtgolf wordt optisch beschreven door de
amplitude (A) van de elektrische (E) vector. De lichtintensiteit (I), die wordt gemeten door
camera's of het oog, is evenredig met het kwadraat van de amplitude (I ∝ A^2) en is altijd
positief.
Het menselijk oog-hersen-systeem detecteert lichtintensiteit en golflengte (kleur), maar kan geen
verschillen in fase of polarisatietoestand waarnemen. Om een object zichtbaar te maken, moet het
contrast vertonen ten opzichte van de achtergrond.
Interactie van licht met materialen:
Transmissie: licht dat door een specimen heen gaat en door het objectief wordt opgevangen,
heet doorgelaten licht. Als het niet wordt geabsorbeerd of afgebogen, blijft het onzichtbaar.
De brekingsindex (n) bepaalt hoe snel licht zich voortplant en hoeveel licht wordt
doorgelaten.
Reflectie: licht dat wordt teruggekaatst door een oppervlak volgt de wet dat invalshoek =
terugkaatsingshoek. Bij diffuse reflectie wordt licht in alle richtingen verstrooid.
Refractie (lichtbreking): het buigen van lichtstralen wanneer zij door het grensvlak tussen
twee media (met verschillende brekingsindices) gaan, wat wordt veroorzaakt door een
verandering in de lichtsnelheid. Dit fenomeen wordt beschreven door de Wet van Snellius en
is de basis van hoe lenzen werken.
Absorptie: Licht kan worden opgenomen door atomen of moleculen, waardoor elektronen
naar een hogere energietoestand gaan (excitatie). Gekleurde of donkere cellen absorberen
bepaalde golflengten of zelfs al het licht. Pigmentkleuren werken volgens dit principe: ze
halen specifieke golflengten uit wit licht.
Diffractie (Verstrooiing): het uitspreiden van licht dat optreedt wanneer een lichtbundel
interageert met een object waarvan de afmetingen vergelijkbaar zijn met de golflengte van
het licht. Diffractie van licht door kleine structurele elementen in het preparaat is het
voornaamste proces dat de beeldvorming in de lichtmicroscoop bepaalt.
Scattering: licht wordt in verschillende richtingen verspreid wanneer een object het licht
absorbeert en opnieuw uitzendt. Dit vermindert bijvoorbeeld het contrast in de retina, waar
vooral blauw licht sterk wordt verstrooid.
,De beeldvorming in een microscoop berust op drie interacties tussen licht en het preparaat:
1. Refractie (lichtbreking)
2. Diffractie (Verstrooiing)
3. Interferentie (Recombinatie): De recombinatie en sommatie van twee of meer lichtgolven.
Dit proces is verantwoordelijk voor het creëren van het reële beeld in de microscoop.
Constructieve interferentie verhoogt de amplitude (heldere plek); destructieve interferentie
verlaagt de amplitude (donkere plek).
Ray Tracing (stralentracing): een methode uit de geometrische optica om te bepalen waar een lens
een beeld vormt. Licht wordt hierbij voorgesteld als rechte stralen die kunnen worden gebroken of
gereflecteerd.
1. Een straal door het midden van de lens wordt niet afgebogen.
2. Een straal parallel aan de optische as gaat na de lens door het brandpunt (F).
3. Een straal die naar het brandpunt gaat, verlaat de lens parallel aan de optische as.\
Staafjes (rods): vormen ongeveer 95% van de fotoreceptoren in de retina en zijn gespecialiseerd in
nachtzicht (scotopisch zicht). Ze zijn extreem lichtgevoelig, ongeveer veertig keer gevoeliger dan
kegeltjes, en werken vooral in donkere omstandigheden. Staafjes nemen geen kleuren waar en
reageren het sterkst op licht rond 510 nm (blauwgroen). Hun belangrijkste pigment is rhodopsine.
Kegeltjes (cones): maken de overige 5% uit en zijn essentieel voor daglichtzicht, kleurwaarneming en
hoge visuele scherpte. Ze zitten voornamelijk in de fovea, waar hun dichte plaatsing de hoge
resolutie van het menselijk zicht mogelijk maakt. Er zijn drie typen kegeltjes (rood-, groen- en
blauwgevoelig), die samen kleur zien mogelijk maken via een tristimulus- (RGB) systeem. De
gevoeligheid voor blauw licht is lager doordat er weinig blauwe kegeltjes zijn en blauw licht sterk
verstrooid wordt in het oog. Groen licht wordt nauwkeuriger waargenomen omdat het zowel groene
als rode kegeltjes activeert.
Resolutie: geeft aan hoe dicht twee punten bij elkaar kunnen liggen, zodat je ze nog steeds als twee
afzonderlijke punten kunt waarnemen. Een hoge resolutie betekent een kleinere afstand die je kunt
onderscheiden.
Point spread function (PSF) = de wiskundige en optische beschrijving van de manier waarop een
optisch systeem (de lens) een enkel punt van licht (een puntbron) verspreidt en afbeeldt.
, De PSF correleert direct met de resolutie van de microscoop. Hoe breder de PSF (de wazige
plek), hoe slechter de resolutie, omdat de vlekken van twee dichtbijgelegen objecten dan
overlappen en u ze niet als afzonderlijke punten kunt onderscheiden.
Ongeacht hoe klein een object is, elk punt dat wordt afgebeeld, wordt verspreid tot een
wazige vlek, de zogenaamde Point Spread Function (PSF). In een ideale lens ziet deze vlek
eruit als een Airy-schijf.
Geen enkel lenzensysteem kan deze vlek tot één enkel punt reduceren; deze vlek is de
diffractielimiet van het optische systeem.
Airy disc = de ideale vorm van de PSF wanneer je een perfect gecorrigeerde lens gebruikt. Dit Airy-
patroon (vernoemd naar Sir George Airy) bestaat uit een heldere centrale vlek (de 0e orde
diffractievlek) omgeven door een reeks concentrische diffractieringen (1e, 2e, 3e orde, enz.).
De ringen en de vlek ontstaan door interferentie (de recombinatie) van het licht dat door de
lens is gegaan. Lichtgolven die door het midden en de rand van de lens reizen, komen exact
in fase aan in het beeldpunt (P') om de heldere vlek te creëren (constructieve interferentie).
Op punten daarnaast (P'') komen de golven uit fase aan, wat leidt tot de donkere ringen
(destructieve interferentie).
De straal (d) van deze diffractievlek is omgekeerd evenredig met de Numerieke Apertuur
(NA) en evenredig met de golflengte (λ) van het gebruikte licht.
λ
o d∝
NA
o Kleinere golflengte (bijvoorbeeld blauw licht) = een hogere resolutie.
o Grotere NA (bijvoorbeeld door olie-immersie) = een hogere resolutie.
NA (Numerieke Apertuur) = een maat voor het lichtverzamelend vermogen van het objectief. Een
hogere NA zorgt voor een kleinere diffractievlek en dus een hogere resolutie.
Brekingsindex (n) = een fundamentele optische eigenschap van een materiaal en definieert de mate
waarin licht buigt wanneer het van het ene medium naar het andere gaat (het fenomeen breking of
