Celbiologie WPO examen
WPO 1 – Inleiding + lichtmicroscoop
Lichtmicroscoop
Köhler belichting
1. Lichtschakelaar aanzetten
2. Preparaat in de houder plaatsen & lokaliseren van het weefsel (5x)
3. Scherpstellen beeld
4. Velddiafragma bijna dichtdraaien
5. Condensor en focus samen scherpstellen
6. Centreren van de diafragma-lichtvlek
7. Velddiafragma opendraaien tot veld juist belicht is
8. Contrast regelen met het apertuurdiafragma
9. Bij hogere vergroting – stappen herhalen
Vervaardigen van preparaten
Waarom? Weefsel is weinig doorlatend en heeft weinig contrast
Doel: cellen & weefsel observeerbaar maken voor LM/EM
Methode
1. Fixen van het weefsel
Doel:
Weefsel vastleggen in de in vivo toestand →behoud oorspronkelijke
structuur
Beschermen van weefsel tegen autolyse, anoxie en microbiele
aantasting
Methodes
- Fysiche fixatie (vloeibare stikstof)
- Chemische fixatie (formaldehyde, osmiumtetroxyde, …)
o Immersie = onderdompelen
o Perfusie = van binnenuit
2. Inbedden
In inbedmiddel (bv. Parafine) – weefsel wordt hard
3. Snijden in plakjes
- Door middel van een microtoom of
Vriesmicrotoom: voor vriescoupes waarbij weefsel zelf niet
ontdooit -> snel maken
Nadeel: delen van weefsel gaan kapot en morfologie is slechter
- Manier van snijden hangt af van het weefsel en geeft een ander
beeld
4. Kleuren / contrasteren
- Kleurstoffen
- Antilichamen
Vriescoupes maken →belangrijk in de pathologie
Celbiologie – WPO examen
2
, Paraffine- / eponcoupes maken →belangrijk in de histologie:
Chemische fixatie door immersie of perfusie → dehydratatie weefsel (70-90-100%
alcohol)
→ alcohol = oplosmiddel voor inbedmiddel
→ inbedden in: paraffine of metacrylaat (LMS)/ epon of metacrylaat (EMS)
→ uitharden inbedmiddel: paraffine → T↓; epon → T↑ → coupes snijden
→ coupes depraraffineren en rehydrateren → coupes kleuren →coupes
dehydrateren, klaren en monteren
Preparaten van celsuspensies
- Maken van een uitstrijkje (vb. voor bloedcellen)
- Bloed volledig uitstrijken en onder microscoop bekijken
- Cytospintechniek (vb. witte bloedcellen) => let op morfologie wordt
aangetast
- Vervaardigen van een celpellet (verwerken als weefsel)
➔ Door niet te centrifugeren gaan alle celsuspensies naar beneden zakken
en de celpelletn vormen.
Toepassingen van de microscoop
Histologie
=bestuderen van weefsels
- Normale weefsels en pathologie
- Gebruik van kleuringen
- Bv. Lever
(centraal bloedvat is omringd door membraan en sinusoïde (groeve
gemaakt door hepatocyten) niet)
Celkweek
- Cellen worden gekweekt door experimenten
- Deze cellen zijn kleurloos (met kleurstoffen gaan ze dood) ->
fasecontrastmicroscoop
- Volgt de groei van cellen
Digitale beeldacquisitie
Digitale camera gekoppeld aan PC capteert beelden
Image analyse software laat toe om metingen uit te voeren:
- Telleningen van levende/dode cellen
- Bepaling van de zuiverheid
- Meten van oppervlak
Verschillende configuraties bestaan:
- Live cell imaging
= incubator om preparaattafel (live celkweek volgen)
- 3D imaging
= module in software
- Video microscopie
= Time-lapse module + motorized stage
Gevaar: fout conclusies trekken door andere beelden (fotoshop)
Celbiologie – WPO examen
2
WPO 1 – Inleiding + lichtmicroscoop
Lichtmicroscoop
Köhler belichting
1. Lichtschakelaar aanzetten
2. Preparaat in de houder plaatsen & lokaliseren van het weefsel (5x)
3. Scherpstellen beeld
4. Velddiafragma bijna dichtdraaien
5. Condensor en focus samen scherpstellen
6. Centreren van de diafragma-lichtvlek
7. Velddiafragma opendraaien tot veld juist belicht is
8. Contrast regelen met het apertuurdiafragma
9. Bij hogere vergroting – stappen herhalen
Vervaardigen van preparaten
Waarom? Weefsel is weinig doorlatend en heeft weinig contrast
Doel: cellen & weefsel observeerbaar maken voor LM/EM
Methode
1. Fixen van het weefsel
Doel:
Weefsel vastleggen in de in vivo toestand →behoud oorspronkelijke
structuur
Beschermen van weefsel tegen autolyse, anoxie en microbiele
aantasting
Methodes
- Fysiche fixatie (vloeibare stikstof)
- Chemische fixatie (formaldehyde, osmiumtetroxyde, …)
o Immersie = onderdompelen
o Perfusie = van binnenuit
2. Inbedden
In inbedmiddel (bv. Parafine) – weefsel wordt hard
3. Snijden in plakjes
- Door middel van een microtoom of
Vriesmicrotoom: voor vriescoupes waarbij weefsel zelf niet
ontdooit -> snel maken
Nadeel: delen van weefsel gaan kapot en morfologie is slechter
- Manier van snijden hangt af van het weefsel en geeft een ander
beeld
4. Kleuren / contrasteren
- Kleurstoffen
- Antilichamen
Vriescoupes maken →belangrijk in de pathologie
Celbiologie – WPO examen
2
, Paraffine- / eponcoupes maken →belangrijk in de histologie:
Chemische fixatie door immersie of perfusie → dehydratatie weefsel (70-90-100%
alcohol)
→ alcohol = oplosmiddel voor inbedmiddel
→ inbedden in: paraffine of metacrylaat (LMS)/ epon of metacrylaat (EMS)
→ uitharden inbedmiddel: paraffine → T↓; epon → T↑ → coupes snijden
→ coupes depraraffineren en rehydrateren → coupes kleuren →coupes
dehydrateren, klaren en monteren
Preparaten van celsuspensies
- Maken van een uitstrijkje (vb. voor bloedcellen)
- Bloed volledig uitstrijken en onder microscoop bekijken
- Cytospintechniek (vb. witte bloedcellen) => let op morfologie wordt
aangetast
- Vervaardigen van een celpellet (verwerken als weefsel)
➔ Door niet te centrifugeren gaan alle celsuspensies naar beneden zakken
en de celpelletn vormen.
Toepassingen van de microscoop
Histologie
=bestuderen van weefsels
- Normale weefsels en pathologie
- Gebruik van kleuringen
- Bv. Lever
(centraal bloedvat is omringd door membraan en sinusoïde (groeve
gemaakt door hepatocyten) niet)
Celkweek
- Cellen worden gekweekt door experimenten
- Deze cellen zijn kleurloos (met kleurstoffen gaan ze dood) ->
fasecontrastmicroscoop
- Volgt de groei van cellen
Digitale beeldacquisitie
Digitale camera gekoppeld aan PC capteert beelden
Image analyse software laat toe om metingen uit te voeren:
- Telleningen van levende/dode cellen
- Bepaling van de zuiverheid
- Meten van oppervlak
Verschillende configuraties bestaan:
- Live cell imaging
= incubator om preparaattafel (live celkweek volgen)
- 3D imaging
= module in software
- Video microscopie
= Time-lapse module + motorized stage
Gevaar: fout conclusies trekken door andere beelden (fotoshop)
Celbiologie – WPO examen
2
