Celbiologie - cel II
h1: prepareren & observeren van cellen en weefsels
doel: cellen & weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
probleem:
● weinig licht (elektronen) doorlaatbaar
● weinig contrast in biologisch materiaal
methodes:
● fixeren
● inbedden & snijden
● kleuren of contrasteren
celcultuur, historisch
● ‘3D tissue culture’
○ 1e analyseerbare weefsel
○ zenuw uit kikkerembryo in lymfe op glasplaatje
● 2D monolaagcultuur
○ simuleren van 3D organen/weefsels (lichaam nabootsen)
● oorspronkelijk: monolaagculturen uit orgaanexplanten (primaire cultuur) in EMEM
→ later: stabiele cellijnen maken met onbeperkte levensduur (geïmmortaliseerd) van
tumorale oorsprong of via selectie (crisis) of door introductie van virale oncogenen
stadia van celcultivering
1. uit weefsel losse cellen krijgen (via enzymes)
2. cellen zakken uit of worden nr bodem gecentrifugeerd
3. cellen worden uitgeplaat in een groeirecipiënt (bv petridish)
4. cellen groeien uit
5. volledige laag → cellen losmaken & splitsen → verdelen over andere recipiënt
typische celculturen
● monocultuur: 1 laag (bv epitheelcellen)
● kolonie: ontstaan uit 1 enkele cel & bestaan uit meerdere cellen (bv tumorcellen)
1
,cultuur condities
= groeimedium waarin cellen kunnen groeien
● MEM ( bestaat uit):
○ isotonische zouten ( NaHCO3/H2CO3-buffer bv)
○ E-bron (glucose)
○ essentiële AZ & vitamines (degene die we zelf niet kunnen synthetiseren)
○ serum (duur)
● andere celmedia (groeimedia): DMEM, M199, McCoy’s, RPMI1640,…
● andere voorwaarden:
○ atmosfeer van 5% CO2 in lucht (in echte atmosfeer maar 0,03%)
○ pH van 7,4 (T = 37°C)
cultuurrecipiënten
● gesloten flessen (falcons): CO2 toevoegen alvorens dicht te draaien, in warme kamer
● open platen (petriplaten): voor in CO2 ovens
● rollerflessen: in warmtekamer, voor een groot oppervlak met cellen maar weinig medium
oorsprong van cellen, cellijnen
→ waaruit cellen vinden?
● primair materiaal (bijv van patiënt, niet gemakkelijk om stabiele cellijnen uit te krijgen) =
eigen isolatie
● cellijnen aankopen (dan weet je met welke cellen je onderzoekt) uit celbanken (ATCC, ECACC)
-> cellijnen kun je invriezen en weer ontdooien om verder experimenten op te doen
groeisubstraten & groeiprocedures
● groeisubstraten = nodig om cellen in vitro te laten groeien, functies:
○ fysische drager: zorgen ervoor dat cellen een opp. hebben om zich aan te hechten &
beschermt cellen tegen anoïks (vorm van geprogrammeerde celdood die optreedt
als cellen zich niet aan een opp. kunnen hechten)
2
, ○ adherente celculturen:
→ meeste cellen zijn adherente cellen → ze moeten aan opp. hechten om te
groeien & overleven
→ sommige celtypen, zoals circulerende bloedcellen of bepaalde tumorcellen
kunnen zonder opp. groeien
● type substraten:
○ glas:
→ heeft een negatieve lading
→ vaak gebruikt voor basis celcultuur
○ voorbehandeld polystyreen:
→ een speciaal behandeld type plastic dat veel wordt gebruikt in labo’s
→ zit in microplaten, flessen, multiplaten, rollers,..
○ coatings voor betere hechting:
→ sommige cellen vereisen extra coatings om zich goed te kunnen hechten:
◦ poly-D-lysine: heeft sterk positieve lading, wat gunstig is voor hechting
◦ collageen: een eiwit dat deel uitmaakt van de ECM (extracellulaire matrix)
◦ geconditioneerd milieu: wordt soms gecreëerd door een feederlaag (een
laag vanondersteunende cellen die signalen & voedingsstoffen afgeeft)
doel van celcultuur
● soorten interacties met micro-omgeving:
○ aspecifieke fysische interactie:
→ toelaten van cellulaire adhesie & celspreading
→ dit heeft betrekking op anchorage-independence = sommige cellen overleven
zonder fysieke hechting, terwijl andere dit absoluut nodig hebben
○ specifieke functionele interactie:
→ interactie met omliggende cellen & de ECM
→ deze interacties zorgen voor: differentiatie-inductie (cellen worden gestimuleerd
om specifieke functies aan te nemen) + contact met het basale membraan
(essentieel voor cellen zoals basale keratinocyten in huid)
3
, celdensiteits-afhankelijke inhibitie
● proces van celproliferatie in cultuur:
1. startfase:
→ cellen in cultuur delen zich & vermenigvuldigen tot ze het gehele opp. bedekken
→ dit leidt tot vorming van een confluente (2D) monolaag waarin cellen dicht
opeengepakt zitten
2. contactinhibtie:
→ zodra de cellen een confluente laag hebben gevormd, stopt celproliferatie
→ dit zorgt voor contactinhibitie: celgroei wordt afgeremd door:
1. fysiek contact tussen cellen
2. concurrerende behoeften aan groeifactoren zoals mitogenen
● hoe proliferatie hervatten?
1. vers medium toevoegen (gaat nt veel doen)
2. splitsen van de cultuur in dochterculturen (dit wel)
→ cellen worden losgemaakt van de ondergrond & van elkaar mbv enzymen zoals
trypsine en een chelator zoals EDTA
→ zo kunnen cellen terug opnieuw groeien & delen
● let op: tumorcellen kunnen het vermogen van contactinhibitie hebben verloren → hierdoor
kunnen ze in groepje/hoopje gaan groeien = 3D
procedure van celtransfer
● celtransfer kan worden uitgevoerd bij:
1. suspensieculturen: cellen in suspensie worden verdund, zacht gecentrifugeerd en
opnieuw opgenomen in vers medium
2. adherente cellen: wnr cellen een confluente monolaag vormen (na 3-7 dagen)
4
h1: prepareren & observeren van cellen en weefsels
doel: cellen & weefsels observeerbaar maken voor LM of EM
probleem:
● weinig licht (elektronen) doorlaatbaar
● weinig contrast in biologisch materiaal
methodes:
● fixeren
● inbedden & snijden
● kleuren of contrasteren
celcultuur, historisch
● ‘3D tissue culture’
○ 1e analyseerbare weefsel
○ zenuw uit kikkerembryo in lymfe op glasplaatje
● 2D monolaagcultuur
○ simuleren van 3D organen/weefsels (lichaam nabootsen)
● oorspronkelijk: monolaagculturen uit orgaanexplanten (primaire cultuur) in EMEM
→ later: stabiele cellijnen maken met onbeperkte levensduur (geïmmortaliseerd) van
tumorale oorsprong of via selectie (crisis) of door introductie van virale oncogenen
stadia van celcultivering
1. uit weefsel losse cellen krijgen (via enzymes)
2. cellen zakken uit of worden nr bodem gecentrifugeerd
3. cellen worden uitgeplaat in een groeirecipiënt (bv petridish)
4. cellen groeien uit
5. volledige laag → cellen losmaken & splitsen → verdelen over andere recipiënt
typische celculturen
● monocultuur: 1 laag (bv epitheelcellen)
● kolonie: ontstaan uit 1 enkele cel & bestaan uit meerdere cellen (bv tumorcellen)
1
,cultuur condities
= groeimedium waarin cellen kunnen groeien
● MEM ( bestaat uit):
○ isotonische zouten ( NaHCO3/H2CO3-buffer bv)
○ E-bron (glucose)
○ essentiële AZ & vitamines (degene die we zelf niet kunnen synthetiseren)
○ serum (duur)
● andere celmedia (groeimedia): DMEM, M199, McCoy’s, RPMI1640,…
● andere voorwaarden:
○ atmosfeer van 5% CO2 in lucht (in echte atmosfeer maar 0,03%)
○ pH van 7,4 (T = 37°C)
cultuurrecipiënten
● gesloten flessen (falcons): CO2 toevoegen alvorens dicht te draaien, in warme kamer
● open platen (petriplaten): voor in CO2 ovens
● rollerflessen: in warmtekamer, voor een groot oppervlak met cellen maar weinig medium
oorsprong van cellen, cellijnen
→ waaruit cellen vinden?
● primair materiaal (bijv van patiënt, niet gemakkelijk om stabiele cellijnen uit te krijgen) =
eigen isolatie
● cellijnen aankopen (dan weet je met welke cellen je onderzoekt) uit celbanken (ATCC, ECACC)
-> cellijnen kun je invriezen en weer ontdooien om verder experimenten op te doen
groeisubstraten & groeiprocedures
● groeisubstraten = nodig om cellen in vitro te laten groeien, functies:
○ fysische drager: zorgen ervoor dat cellen een opp. hebben om zich aan te hechten &
beschermt cellen tegen anoïks (vorm van geprogrammeerde celdood die optreedt
als cellen zich niet aan een opp. kunnen hechten)
2
, ○ adherente celculturen:
→ meeste cellen zijn adherente cellen → ze moeten aan opp. hechten om te
groeien & overleven
→ sommige celtypen, zoals circulerende bloedcellen of bepaalde tumorcellen
kunnen zonder opp. groeien
● type substraten:
○ glas:
→ heeft een negatieve lading
→ vaak gebruikt voor basis celcultuur
○ voorbehandeld polystyreen:
→ een speciaal behandeld type plastic dat veel wordt gebruikt in labo’s
→ zit in microplaten, flessen, multiplaten, rollers,..
○ coatings voor betere hechting:
→ sommige cellen vereisen extra coatings om zich goed te kunnen hechten:
◦ poly-D-lysine: heeft sterk positieve lading, wat gunstig is voor hechting
◦ collageen: een eiwit dat deel uitmaakt van de ECM (extracellulaire matrix)
◦ geconditioneerd milieu: wordt soms gecreëerd door een feederlaag (een
laag vanondersteunende cellen die signalen & voedingsstoffen afgeeft)
doel van celcultuur
● soorten interacties met micro-omgeving:
○ aspecifieke fysische interactie:
→ toelaten van cellulaire adhesie & celspreading
→ dit heeft betrekking op anchorage-independence = sommige cellen overleven
zonder fysieke hechting, terwijl andere dit absoluut nodig hebben
○ specifieke functionele interactie:
→ interactie met omliggende cellen & de ECM
→ deze interacties zorgen voor: differentiatie-inductie (cellen worden gestimuleerd
om specifieke functies aan te nemen) + contact met het basale membraan
(essentieel voor cellen zoals basale keratinocyten in huid)
3
, celdensiteits-afhankelijke inhibitie
● proces van celproliferatie in cultuur:
1. startfase:
→ cellen in cultuur delen zich & vermenigvuldigen tot ze het gehele opp. bedekken
→ dit leidt tot vorming van een confluente (2D) monolaag waarin cellen dicht
opeengepakt zitten
2. contactinhibtie:
→ zodra de cellen een confluente laag hebben gevormd, stopt celproliferatie
→ dit zorgt voor contactinhibitie: celgroei wordt afgeremd door:
1. fysiek contact tussen cellen
2. concurrerende behoeften aan groeifactoren zoals mitogenen
● hoe proliferatie hervatten?
1. vers medium toevoegen (gaat nt veel doen)
2. splitsen van de cultuur in dochterculturen (dit wel)
→ cellen worden losgemaakt van de ondergrond & van elkaar mbv enzymen zoals
trypsine en een chelator zoals EDTA
→ zo kunnen cellen terug opnieuw groeien & delen
● let op: tumorcellen kunnen het vermogen van contactinhibitie hebben verloren → hierdoor
kunnen ze in groepje/hoopje gaan groeien = 3D
procedure van celtransfer
● celtransfer kan worden uitgevoerd bij:
1. suspensieculturen: cellen in suspensie worden verdund, zacht gecentrifugeerd en
opnieuw opgenomen in vers medium
2. adherente cellen: wnr cellen een confluente monolaag vormen (na 3-7 dagen)
4
