Samenvatting Bio-methoden
Minimal residual disease (MRD)
Het minimale aantal tumorcellen dat nodig is om een relapse (terugkeren van de ziekte) te krijgen.
Met behulp van PCR kan al een zeer klein aantal tumorcellen worden bepaald.
RNA (Ribonucleic acid)
Verschillen tussen RNA en DNA:
RNA:
- Enkelstrengs
- Ribose als pentosesuiker (met een 2'-OH groep)
- Uracil (U) als stikstofbase
DNA:
- Dubbelstrengs
- Deoxyribose als pentosesuiker (met een 2' H-groep)
- Thymine (T) als stikstofbase
Er zijn 3 verschillende soorten RNA:
1. mRNA: is een boodschappen van het genetisch materiaal en brengt een kopie van het
genetisch materiaal vanuit de celkern naar de ribosomen, zodat het genetisch materiaal kan
worden omgezet in eiwitten.
2. tRNA: speelt een functie bij de translatie van het mRNA doordat het tRNA met een specifiek
gebonden aminozuur (overeenkomend met het anticodon van het tRNA) kan binden op de A-
site van het ribosoom, doordat het anticodon complementair is aan een codon op het mRNA
3. rRNA: is onderdeel van de ribosomen. katalyseert de reactie die eiwitketens verlengt.
mRNA wordt gevormd door DNA dat tijdens de transcriptie omgezet wordt in pre-mRNA. De pre-
mRNA streng wordt complementair aan de non-sense DNA streng gevormd, zodat het mRNA sense is
en het de genetische code bevat. Daarna wordt het pre-mRNA omgezet in mRNA.
MRD-experiment
Het doel van het experiment is om het aantal K562 cellen (tumorcellen) met de BCR-Abl translocatie
in een onbekend monster te bepalen met behulp van real time PCR en de Pfaffl methode, door de
genexpressie van het BCR-Abl gen te vergelijken met de genexpressie van het GAPDH gen.
Tijdens dit experiment worden K562 cellen gebruikt die zijn geïsoleerd uit een CML-patiënt. CML
staat voor Chronische myeloïde leukemie. Bij deze patiënten wordt vaak de BCR-Abl translocatie
gevonden. Bij deze translocatie verplaatst het Abl proto-oncogen van chromosoom 9 naar
chromosoom 22, waar het met het BCR-gen fuseert. Hierdoor ontstaat het BCR-Abl oncogen op het
nieuwgevormde chromosoom. Dit chromosoom wordt ook wel het Philadelphia chromosoom
genoemd.
Als normale cellen (referentie) worden de Jurkat cellen gebruikt, dus zonder translocatie.
De expressie van het BCR-Abl gen wordt vergeleken met een huishoud gen. Een Huishoud gen is een
gen die in alle cellen aanwezig is, het huishoud gen moet constant blijven en niet reageren op de
handelingen die worden uitgevoerd.
,Als huishoud gen is gekozen voor GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) dit gen
codeert voor eiwitten die essentieel zijn voor normale cel-functies. GAPDH is in de Jurkat cellen en in
de K562 cellen evenveel aanwezig.
Waar moet een goed huishoud gen aan voldoen?
- In alle cellen onder alle omstandigheden in vergelijkbare mate tot expressie komen.
- Hij moet in alle cellen aanwezig zijn.
- niet gevoelig zijn voor bepaalde behandelingen.
- Constante expressie
- Komt in dezelfde mate tot expressie als je gen van interesse.
- Primer efficiënties moeten vergelijkbaar zijn met je gen van interesse.
Flowchart MRD-experiment:
Dag 1:
- K562 cellen en Jurkat cellen in kweek tellen m.b.v. Bürker telkamer.
- Ijklijn pipetteren met 0-100% K562 cellen.
- RNA-isolatie m.b.v. TRIzol reagent
- Concentratie en zuiverheid meten van het geïsoleerde RNA m.b.v. Nanodrop.
- Kwaliteit van het geïsoleerde RNA bepalen m.b.v. Agarose gel elektroforese
Dag 2:
- cDNA synthese m.b.v. M-MLV RT door middel van RT-PCR
- Real time PCR met SYBR-green en primers tegen BCR-Abl en GAPDH.
- Uitwerken met Pfaffl methode.
Cellen tellen
De cellen worden geteld om te bepalen welk volume van elke kweek aan elk monster moet worden
toegevoegd om het aantal cellen in beide monsters gelijk te hebben.
De cellen worden verdund met Tryptaanblauw. Deze stof kan niet door een intact celmembraan
heendringen waardoor alleen de dode cellen worden gekleurd. Onder microscoop kan vervolgens het
aantal levende cellen worden geteld met behulp van de telkamer. Hieruit kan het aantal cellen van
de onverdunde kweek bepaald worden.
Ijklijn pipetteren (0-100% K562 cellen)
Er wordt een cel-concentratie reeks gepipetteerd met 0-100% K562 cellen, die waar dat nodig is
worden aangevuld met Jurkat cellen, zodat elk monster 2 miljoen cellen bevat.
RNA-isolatie
Het RNA wordt tijdens dit experiment geïsoleerd omdat mRNA alleen exonen bevat en geen intronen
omdat die eruit zijn gehaald tijdens splicing. mRNA geeft hierdoor informatie over de genexpressie
terwijl DNA dit niet geeft. Exonen coderen namelijk voor eiwitten.
Er moet RNase vrij gewerkt worden door handschoenen te dragen omdat dit een enzym is dat RNA
kan afbreken en zich op de handen bevindt.
, Het RNA wordt geïsoleerd met behulp van TRIzol reagent. Dit bestaat uit fenol en guanidine
isothyocyanate.
- Combinatie van fenol en guanidine isothyocyanate in TRIzol zorgt voor cel lysis, waardoor de
cel inhoud vrijkomt.
- Het vrijgekomen RNA wordt beschermd tegen RNase door guanidine isothyocyanate.
- Door de lage pH van het TRIzol reagent komt RNA in de waterige fase.
bij een hoge of neutrale pH zou DNA in de waterige fase komen.
- Daarna wordt Chloroform toegevoegd wat ervoor zorgt dat er een fasescheiding ontstaat.
Onderin een rood/roze fenol/chloroform fase met eiwitten en vetten
een interfase met DNA
Bovenin een waterige fase met RNA en guanidine isothyocyanate.
- De waterige fase wordt geïsoleerd en er wordt Isopropanol toegevoegd waardoor RNA-
precipitatie ontstaat. na centrifugeren vormt zich een RNA pellet.
- Het RNA wordt vervolgens gewassen met 75% ethanol om de restanten van de organische
oplosmiddelen te verwijderen en daarna werd het pellet gedroogd.
- Het RNA pellet wordt geresuspendeerd in DEPC-water en verwarmd.
Nanodrop
Nanodrop is een spectrofotometer in het UV-gebied (180-380nm) en bestaat uit een lichtbron,
monochromator (selectie van golflengte), sample, lichtdetector en een computer om het resultaat op
weer te geven.
Hoe hoger de gemeten absorptie hoe hoger de concentratie in het sample. Dit berust op de wet van
Lambert-beer: A= E*c*l. Hierbij zijn E en l vaste waarden dus de Absorptie staat in direct verband met
de concentratie van het sample.
Bij deze golflengtes worden de volgende stoffen gemeten met Nanodrop:
230 nm: organische oplosmiddelen.
260 nm: RNA en DNA en ook losse nucleotiden
270 nm: fenol
280 nm: eiwitten
320 nm: algemene achtergrond monster
Bij de Nanodrop wordt ook de 260/280 ratio weergeven. Dit zegt wat over de verhouding tussen de
gemeten absorptie bij 260 (RNA/DNA) en de gemeten absorptie bij 280 (eiwitten). Hiermee zegt het
wat over de zuiverheid van het geïsoleerde RNA/DNA door de besmetting met eiwitten vast te
stellen. Een waarde tussen de 1,8 en 2,2 is goed. Een waarde onder de 1,8 duidt op besmetting.
Deze ratio wordt beïnvloed door de pH, een hogere pH leidt tot een lagere eiwitconcentratie omdat
er denaturatie van de eiwitten ontstaat. De A280 wordt hierdoor lager en de A260 blijft gelijk
waardoor de 260/280 ratio hoger wordt bij een hogere pH.
Minimal residual disease (MRD)
Het minimale aantal tumorcellen dat nodig is om een relapse (terugkeren van de ziekte) te krijgen.
Met behulp van PCR kan al een zeer klein aantal tumorcellen worden bepaald.
RNA (Ribonucleic acid)
Verschillen tussen RNA en DNA:
RNA:
- Enkelstrengs
- Ribose als pentosesuiker (met een 2'-OH groep)
- Uracil (U) als stikstofbase
DNA:
- Dubbelstrengs
- Deoxyribose als pentosesuiker (met een 2' H-groep)
- Thymine (T) als stikstofbase
Er zijn 3 verschillende soorten RNA:
1. mRNA: is een boodschappen van het genetisch materiaal en brengt een kopie van het
genetisch materiaal vanuit de celkern naar de ribosomen, zodat het genetisch materiaal kan
worden omgezet in eiwitten.
2. tRNA: speelt een functie bij de translatie van het mRNA doordat het tRNA met een specifiek
gebonden aminozuur (overeenkomend met het anticodon van het tRNA) kan binden op de A-
site van het ribosoom, doordat het anticodon complementair is aan een codon op het mRNA
3. rRNA: is onderdeel van de ribosomen. katalyseert de reactie die eiwitketens verlengt.
mRNA wordt gevormd door DNA dat tijdens de transcriptie omgezet wordt in pre-mRNA. De pre-
mRNA streng wordt complementair aan de non-sense DNA streng gevormd, zodat het mRNA sense is
en het de genetische code bevat. Daarna wordt het pre-mRNA omgezet in mRNA.
MRD-experiment
Het doel van het experiment is om het aantal K562 cellen (tumorcellen) met de BCR-Abl translocatie
in een onbekend monster te bepalen met behulp van real time PCR en de Pfaffl methode, door de
genexpressie van het BCR-Abl gen te vergelijken met de genexpressie van het GAPDH gen.
Tijdens dit experiment worden K562 cellen gebruikt die zijn geïsoleerd uit een CML-patiënt. CML
staat voor Chronische myeloïde leukemie. Bij deze patiënten wordt vaak de BCR-Abl translocatie
gevonden. Bij deze translocatie verplaatst het Abl proto-oncogen van chromosoom 9 naar
chromosoom 22, waar het met het BCR-gen fuseert. Hierdoor ontstaat het BCR-Abl oncogen op het
nieuwgevormde chromosoom. Dit chromosoom wordt ook wel het Philadelphia chromosoom
genoemd.
Als normale cellen (referentie) worden de Jurkat cellen gebruikt, dus zonder translocatie.
De expressie van het BCR-Abl gen wordt vergeleken met een huishoud gen. Een Huishoud gen is een
gen die in alle cellen aanwezig is, het huishoud gen moet constant blijven en niet reageren op de
handelingen die worden uitgevoerd.
,Als huishoud gen is gekozen voor GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) dit gen
codeert voor eiwitten die essentieel zijn voor normale cel-functies. GAPDH is in de Jurkat cellen en in
de K562 cellen evenveel aanwezig.
Waar moet een goed huishoud gen aan voldoen?
- In alle cellen onder alle omstandigheden in vergelijkbare mate tot expressie komen.
- Hij moet in alle cellen aanwezig zijn.
- niet gevoelig zijn voor bepaalde behandelingen.
- Constante expressie
- Komt in dezelfde mate tot expressie als je gen van interesse.
- Primer efficiënties moeten vergelijkbaar zijn met je gen van interesse.
Flowchart MRD-experiment:
Dag 1:
- K562 cellen en Jurkat cellen in kweek tellen m.b.v. Bürker telkamer.
- Ijklijn pipetteren met 0-100% K562 cellen.
- RNA-isolatie m.b.v. TRIzol reagent
- Concentratie en zuiverheid meten van het geïsoleerde RNA m.b.v. Nanodrop.
- Kwaliteit van het geïsoleerde RNA bepalen m.b.v. Agarose gel elektroforese
Dag 2:
- cDNA synthese m.b.v. M-MLV RT door middel van RT-PCR
- Real time PCR met SYBR-green en primers tegen BCR-Abl en GAPDH.
- Uitwerken met Pfaffl methode.
Cellen tellen
De cellen worden geteld om te bepalen welk volume van elke kweek aan elk monster moet worden
toegevoegd om het aantal cellen in beide monsters gelijk te hebben.
De cellen worden verdund met Tryptaanblauw. Deze stof kan niet door een intact celmembraan
heendringen waardoor alleen de dode cellen worden gekleurd. Onder microscoop kan vervolgens het
aantal levende cellen worden geteld met behulp van de telkamer. Hieruit kan het aantal cellen van
de onverdunde kweek bepaald worden.
Ijklijn pipetteren (0-100% K562 cellen)
Er wordt een cel-concentratie reeks gepipetteerd met 0-100% K562 cellen, die waar dat nodig is
worden aangevuld met Jurkat cellen, zodat elk monster 2 miljoen cellen bevat.
RNA-isolatie
Het RNA wordt tijdens dit experiment geïsoleerd omdat mRNA alleen exonen bevat en geen intronen
omdat die eruit zijn gehaald tijdens splicing. mRNA geeft hierdoor informatie over de genexpressie
terwijl DNA dit niet geeft. Exonen coderen namelijk voor eiwitten.
Er moet RNase vrij gewerkt worden door handschoenen te dragen omdat dit een enzym is dat RNA
kan afbreken en zich op de handen bevindt.
, Het RNA wordt geïsoleerd met behulp van TRIzol reagent. Dit bestaat uit fenol en guanidine
isothyocyanate.
- Combinatie van fenol en guanidine isothyocyanate in TRIzol zorgt voor cel lysis, waardoor de
cel inhoud vrijkomt.
- Het vrijgekomen RNA wordt beschermd tegen RNase door guanidine isothyocyanate.
- Door de lage pH van het TRIzol reagent komt RNA in de waterige fase.
bij een hoge of neutrale pH zou DNA in de waterige fase komen.
- Daarna wordt Chloroform toegevoegd wat ervoor zorgt dat er een fasescheiding ontstaat.
Onderin een rood/roze fenol/chloroform fase met eiwitten en vetten
een interfase met DNA
Bovenin een waterige fase met RNA en guanidine isothyocyanate.
- De waterige fase wordt geïsoleerd en er wordt Isopropanol toegevoegd waardoor RNA-
precipitatie ontstaat. na centrifugeren vormt zich een RNA pellet.
- Het RNA wordt vervolgens gewassen met 75% ethanol om de restanten van de organische
oplosmiddelen te verwijderen en daarna werd het pellet gedroogd.
- Het RNA pellet wordt geresuspendeerd in DEPC-water en verwarmd.
Nanodrop
Nanodrop is een spectrofotometer in het UV-gebied (180-380nm) en bestaat uit een lichtbron,
monochromator (selectie van golflengte), sample, lichtdetector en een computer om het resultaat op
weer te geven.
Hoe hoger de gemeten absorptie hoe hoger de concentratie in het sample. Dit berust op de wet van
Lambert-beer: A= E*c*l. Hierbij zijn E en l vaste waarden dus de Absorptie staat in direct verband met
de concentratie van het sample.
Bij deze golflengtes worden de volgende stoffen gemeten met Nanodrop:
230 nm: organische oplosmiddelen.
260 nm: RNA en DNA en ook losse nucleotiden
270 nm: fenol
280 nm: eiwitten
320 nm: algemene achtergrond monster
Bij de Nanodrop wordt ook de 260/280 ratio weergeven. Dit zegt wat over de verhouding tussen de
gemeten absorptie bij 260 (RNA/DNA) en de gemeten absorptie bij 280 (eiwitten). Hiermee zegt het
wat over de zuiverheid van het geïsoleerde RNA/DNA door de besmetting met eiwitten vast te
stellen. Een waarde tussen de 1,8 en 2,2 is goed. Een waarde onder de 1,8 duidt op besmetting.
Deze ratio wordt beïnvloed door de pH, een hogere pH leidt tot een lagere eiwitconcentratie omdat
er denaturatie van de eiwitten ontstaat. De A280 wordt hierdoor lager en de A260 blijft gelijk
waardoor de 260/280 ratio hoger wordt bij een hogere pH.
