OPEN VRAGEN CELBIOLOGIE
HOOFDSTUK 1: NUCLEUS-GENOOM-3D-ORGANISATIE
Bespreek hogere orde 3d genoom organisatie-niveaus.
De hogere orde 3D genoomorganisatie beschrijft hoe het DNA ruimtelijk is georganiseerd in de celkern en
hoe dit de genregulatie beïnvloedt. Deze organisatie gaat verder dan de lineaire DNA-sequentie en is
hiërarchisch opgebouwd. Als basis is DNA verpakt in nucleosomen, waarbij DNA rond histonen is
gewikkeld. Histonmodificaties (bv acetylatie en methylatie) bepalen de toegankelijkheid van het
chromatine en leiden tot euchromatine of heterochromatine. Deze niveaus vormen de structurele basis,
maar behoren niet tot de hogere orde organisatie.
Op een eerste hoger niveau vormt chromatine lussen (chromatineloops). Hierbij worden promotors en
distale regulatorische elementen zoals enhancers fysiek bij elkaar gebracht. Deze lussen worden vnl
gemedieerd door de eiwitten CTCF en cohesine en maken gerichten en efficiëntie genregulatie mogelijk.
Verschillende lussen worden gegroepeerd in Topologically Associating Domains (TADs). Binnen een TAD
interageren DNA-sequenties veel vaker met elkaar dan met sequenties buiten het domein. TADs
functioneren als afbakenende regulatoire eenheden en voorkomen foutieve enhancer-promotor-
interacties. De grenzen van TADs worden vaak bepaald door CTCF-bindingsplaatsen.
Een deel van het genoom is georganiseerd in Lamina-Associated Domains (LADs). Dit zijn grote
chromatinedomeinen die verbonden zijn met de nucleaire lamina aan de kernperiferie. LADs zijn meestal
genarm, heterochtomatisch en transcriptioneel inactief en dragen bij aan genrepressie.
Op een nog hoger niveau worden TADs gegroepeerd in chromatinecompartimenten:
- A-compartimenten: euchromatine, genrijk en transcriptioneel actief
- B-compartimenten: heterochromatine, genarm en meestal inactief
ð Deze compartimenten weerspiegelen grootschalige functionele verschillen in het genoom
Op het hoogste niveau worden TADs gegroepeerd in chromosoomterritoria. Elk chromosoom neemt een
eigen, niet-willekeurige positie in binnen de celkern. Actieve chromosoomregio’s liggen vaker centraal in
de kern, terwijl inactieve regio’s vaker aan de periferie voorkomen. Deze ruimtelijke positionering draagt bij
aan correcte genregulatie en genoomstabiliteit.
Samen zorgen deze hogere orde 3D-organisatieniveaus ervoor dat genen op de juiste plaats en het juiste
moment tot expressie komen en spelen ze een essentiële rol in celspecificiteit en differentiatie.
Bespreek de rol van de nucleaire organisatie in 3D genoomorganisatie.
De nucleaire organisatie speelt een belangrijke rol in de 3D-genoomorganisatie doordat zij bepaalt waar
DNA zich bevindt in de celkern en welke genen actief of inactief zijn. De nucleus is geen homogeen
compartiment, maar een ruimtelijk geordende dynamische omgeving waarin DNA op een niet-willekeurige
manier wordt gepositioneerd.
Binnen de nucleus zorgt nucleaire compartimentalisatie ervoor dat de genoomregio’s met gelijkaardige
functie of regulatie bij elkaar worden gebracht. Actieve genen bevinden zich meestal in het kerninterieur,
,waar ze deel uitmaken van euchromatische regio’s en transcriptionele hubs, terwijl inactieve en
heterochromatische gebieden vaak gelokaliseerd zijn aan de nucleaire periferie en verankerd zijn aan
de nucleaire lamina in de vorm van LADs. Deze perifere positionering draagt bij aan gensilencing en
genoomstabiliteit.
Deze ruimtelijke organisatie bevordert de vorming en stabiliteit van chromatineloops, TADs en A/B-
compartimenten. Door deze hiërarchische organisatie worden enhancer-promotor-interacties ruimtelijk
beperkt tot functionele domeinen, wat een nauwkeurige genregulatie mogelijk maakt en foutieve
genactivatie voorkomt. Op het hoogste niveau nemen chromoosmen vaste chromosoomterritoria in,
waardoor ongewenste interchromosomale contacten worden beperkt.
De nucleaire organisatie is dynamisch en kan veranderen tijdens differentiatie of in respons op signalen,
waardoor genexpressieprogramma’s aangepast worden aan de functionele toestand van de cel. De positie
van DNA in de nucleus bepaalt dus in sterke mate genregulatie en celfunctie.
Hoe kan mechanische stress zorgen voor 3D genoomorganisatie?
Mechanische stress kan de 3D-organisatie van het genoom beïnvloeden doordat fysieke krachten uit de
celomgeving worden doorgegeven aan de celkern en daar de ruimtelijke organisatie van chromatine
veranderen, zonder dat er DNA-mutaties nodig zijn.
Cellen ervaren mechanische krachten zoals rek, compressie en shear stress, afkomstig van de
extracellulaire matrix, celadhesie en celmigratie. Deze krachten worden doorgegeven via het cytoskelet
(actinefilamenten, microtubuli en intermediaire filamenten) naar de nucleus via het LINC-complex. In dit
complex verbinden nesprine-eiwitten (aan de buitenzijde van de kern) het cytoskelet met SUN-eiwitten
(aan de binnenzijde van de nucleaire envelop).
Vanuit het LINC-complex worden krachten overgebracht op de nucleaire lamina, een netwerk van lamine-
aiwitten dat de kern vorm en mechanische stabiliteit geeft. De nucleaire lamina staat in direct contact met
chromatine, met name via LADs. Hierdoor kunnen mechanische krachten leiden tot:
- Vervorming van de kern
- Verandering in chromatinecompactie (euchromatine « heterochromatine)
- Herschikking van TADs en LADs, waardoor genoomregio’s van positie veranderen binnen de kern
Deze ruimtelijke herschikking kan enhancer-promotor-interacties wijzigen en zo leiden tot aangepaste
genexpressieprogramma’s, bijvoorbeeld tijdens migratie, differentiatie of in tumoren onder fysieke druk.
Verklaar ziektebeeld Progeria.
Progeria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) is een zeldzaam genetisch verouderingssyndroom dat
wordt veroorzaakt door een mutatie in het LMNA-gen op chromosoom 1. Dit gen codeert voor de nucleaire
lamines lamine A en C, structurele eiwitten van de nucleaire lamina die essentieel zijn voor kernvorm,
mechanische stabiliteit en 3D-genoomorganisatie.
Bij Progeria veroorzaakt een puntmutatie (G608G) in het LMNA-gen het ontstaan van een cryptische
splice site. Hierdoor wordt een abnormale, verkorte vorm van lamine A geproduceerd: progerine.
Progerine mist een deel dat normaal nodig is voor correcte verwerking en blijft permanent gefarnesyleerd,
waardoor het zich opstapelt in de nucleaire lamina.
De accumulatie van progerine verstoort de structuur van de nucleaire envelop, wat leidt tot een
gerimpelde en vervormde celkern (nuclear blebbing) en verlies van kernelasticiteit. Doordat de nucleaire
,lamina beschadigd is, kunnen LADs niet meer goed aan de lamina verankeren. Hierdoor raakt de 3D-
genoomorganisatie ontregeld, inclusief de positionering van heterochromatine en de organisatie van
TADs (LADs soort van vervangen door TADs).
Deze structurele en organisatorische verstoringen leiden tot foutieve genexpressie, verhoogde DNA-
schade, verminderde DNA-reparatie en replicatiestress, wat resulteert in versnelde cellulaire
veroudering.
Klinisch uit zich dit in een vroegtijdig verouderingsfenotype, met groeiachterstand, verlies van subcutaan
vet, skeletafwijkingen en vooral ernstige cardiovasculaire aandoeningen, die de belangrijkste
doordsoorzaak zijn bij patiënten met Progeria.
Verklaar de rol van chromatineveranderingen in nucleaire fluïditeit en fasescheiding.
Chromatineveranderingen spelen een centrale rol in het bepalen van de nucleaire fluïditeit en de fase-
scheiding binnen de celkern. De nucleus is geen homogeen vloeibaar compartiment, maar bestaat uit
regio’s met verschillende fysische eigenschappen (zoals viscositeit en elasticiteit), die rechtstreeks
worden bepaald door de condensatietoestand en chemie van chromatine.
Chromatine en nucleaire fluïditeit
De mate van chromatinecondensatie beïnvloedt hoe vrij moleculen zich binnen de kern kunnen bewegen:
- Euchromatine
o Minder gecondenseerd
o Rijk aan histonacetylaties
o Relatief hydrofiel
o Hoge mobiliteit van chromatine en nucleaire eiwitten
o Zorgt voor een meer vloeibare (liquid-like) nucleaire omgeving en actieve genexpressie
- Heterochromatine
o Sterk gecondenseerd
o Verrijkt in histonmethylaties (bv H3K9me3)
o Bindt eiwitten zoals HP1
o Relatief minder dynamisch
o Creëert een meer stijve en minder fluïde (solid-like) nucleaire omgeving en genrepressie
Chromatine en fase-scheiding
Verschillen in chromatine-eigenschappen leiden tot liquid-liquid phase seperation (LLPS) in de kern.
Hierdoor ontstaan membraanloze nucleaire compartimenten, waarin specifieke eiwitten en
nucleïnezuten worden geconcentreerd.
- Actief, euchromatisch chromatine associeert met hydrofiele fasen, zoals het A-compartiment
en met nucleaire speckles.
- Repressief, heterochromatisch chromatine clustert in repressieve fasen, zoals het B-
compartiment en LADs aan de nucleaire periferie.
Nucleaire speckles als voorbeeld
Nucleaire speckles zijn dynamische, fase-gescheiden condensaten rijk aan RNA-processingfactoren
(zoals splicingfactoren). Ze fungeren als assemblage- en opslagplaatsen voor transcriptie- en
splicingmechinerie. Actieve genen en euchromatine-lussen positioneren zich vaak aan de rand van
, speckles, wat efficiënte RNA-verwerking bevordert. Speckles kunnen fuseren, fragmenteren en van grootte
veranderen, wat bijdraagt aan de dynamiek en fluïditeit van de nucleus.
TADs, LADs en 3D-organisatie
- TADs zijn structurele luseenheden waarvan de interne interacties gevoelig zijn voor epigenetische
veranderingen.
- LADs zijn typisch heterochromatisch, minder fluïde en gelokaliseerd aan de nucleaire lamina.
- Veranderingen in histonmodificaties kunnen LADs losmaken van de lamina en verplaatsen naar
het meer fluïde nucleoplasma, vaak gepaard met genactivatie.
Bespreek/interpreteer 3C-HiC TAD afbeelding.
Hi-C is een genome-wide uitbreiding van de Chromosome Conformation Capture (3C)-technologie en
meet fysieke contactfrequenties tussen alle genomische loci in de celkern. DNA-regio’s die in 3D dicht
bij elkaar liggen, worden na fixatie, digestie en ligatie samen gesequenced. De resultaten worden
weergegeven als een contactmatrix (heatmap).
(Uitvoering (niet gevraagd):
1. Crosslinking (fixatie): formaldehyde
a. Formaldehyde vormt covalente bindingen tussen DNA & eiwitten (histonen, CTCF,
cohesin), en tussen eiwitten onderling
b. Hierdoor wordt de 3D-chromatinestructuur ‘bevroren’ op het moment van fixatie
c. DNA-regio’s die fysiek dicht bij elkaar liggen (lussen, TAD-interacties) blijven gekoppeld
2. Restrictie-digest: gefixeerde chromatine wordt geknipt met een restrictie-enzym
a. Knipt DNA op specifieke herkenningsplaatsen
b. Creëert korte DNA-fragmenten
c. Fragmenten die in 3D dicht bij elkaar lagen, blijven via crosslinks bij elkaar
3. End-fill en labeling (specifiek voor Hi-C)
a. De DNA-uiteinden worden:
i. Opgevuld (end-fill)
ii. Gelabeld met biotine-gemodificeerde nucleotiden
b. Hierdoor kunnen later echte ligatie-junctions selectief worden verrijkt
4. Ligatie (verdunning!) à DNA-ligatie gebeurt onder sterk verdunde omstandigheden
a. Doel: intramoleculaire ligatie bevorderen
b. DNA-uiteinden die door crosslinking dicht bij elkaar liggen, worden aan elkaar geligeerd
c. Resultaat:
i. Eén DNA-fragment dat twee oorspronkelijk ver uit elkaar liggende loci bevat
ii. Dit fragment representeert een fysiek contact in de nucleus
5. Crosslink reversal & DNA-zuivering
a. Crosslinks worden verwijderd
b. Eiwitten verdwijnen
c. DNA blijft achter met ligatie-producten die 3D-interacties coderen
6. Fragmentatie & verrijking (Hi-C)
a. DNA wordt verder gefragmenteerd (sonicatie)
b. Biotine-gelabelde fragmenten worden geïsoleerd met streptavidine-beads
c. Enkel echte Hi-C contacten blijven over
7. Sequencing (NGS)
a. Fragmenten worden klaargemaakt voor NGS
HOOFDSTUK 1: NUCLEUS-GENOOM-3D-ORGANISATIE
Bespreek hogere orde 3d genoom organisatie-niveaus.
De hogere orde 3D genoomorganisatie beschrijft hoe het DNA ruimtelijk is georganiseerd in de celkern en
hoe dit de genregulatie beïnvloedt. Deze organisatie gaat verder dan de lineaire DNA-sequentie en is
hiërarchisch opgebouwd. Als basis is DNA verpakt in nucleosomen, waarbij DNA rond histonen is
gewikkeld. Histonmodificaties (bv acetylatie en methylatie) bepalen de toegankelijkheid van het
chromatine en leiden tot euchromatine of heterochromatine. Deze niveaus vormen de structurele basis,
maar behoren niet tot de hogere orde organisatie.
Op een eerste hoger niveau vormt chromatine lussen (chromatineloops). Hierbij worden promotors en
distale regulatorische elementen zoals enhancers fysiek bij elkaar gebracht. Deze lussen worden vnl
gemedieerd door de eiwitten CTCF en cohesine en maken gerichten en efficiëntie genregulatie mogelijk.
Verschillende lussen worden gegroepeerd in Topologically Associating Domains (TADs). Binnen een TAD
interageren DNA-sequenties veel vaker met elkaar dan met sequenties buiten het domein. TADs
functioneren als afbakenende regulatoire eenheden en voorkomen foutieve enhancer-promotor-
interacties. De grenzen van TADs worden vaak bepaald door CTCF-bindingsplaatsen.
Een deel van het genoom is georganiseerd in Lamina-Associated Domains (LADs). Dit zijn grote
chromatinedomeinen die verbonden zijn met de nucleaire lamina aan de kernperiferie. LADs zijn meestal
genarm, heterochtomatisch en transcriptioneel inactief en dragen bij aan genrepressie.
Op een nog hoger niveau worden TADs gegroepeerd in chromatinecompartimenten:
- A-compartimenten: euchromatine, genrijk en transcriptioneel actief
- B-compartimenten: heterochromatine, genarm en meestal inactief
ð Deze compartimenten weerspiegelen grootschalige functionele verschillen in het genoom
Op het hoogste niveau worden TADs gegroepeerd in chromosoomterritoria. Elk chromosoom neemt een
eigen, niet-willekeurige positie in binnen de celkern. Actieve chromosoomregio’s liggen vaker centraal in
de kern, terwijl inactieve regio’s vaker aan de periferie voorkomen. Deze ruimtelijke positionering draagt bij
aan correcte genregulatie en genoomstabiliteit.
Samen zorgen deze hogere orde 3D-organisatieniveaus ervoor dat genen op de juiste plaats en het juiste
moment tot expressie komen en spelen ze een essentiële rol in celspecificiteit en differentiatie.
Bespreek de rol van de nucleaire organisatie in 3D genoomorganisatie.
De nucleaire organisatie speelt een belangrijke rol in de 3D-genoomorganisatie doordat zij bepaalt waar
DNA zich bevindt in de celkern en welke genen actief of inactief zijn. De nucleus is geen homogeen
compartiment, maar een ruimtelijk geordende dynamische omgeving waarin DNA op een niet-willekeurige
manier wordt gepositioneerd.
Binnen de nucleus zorgt nucleaire compartimentalisatie ervoor dat de genoomregio’s met gelijkaardige
functie of regulatie bij elkaar worden gebracht. Actieve genen bevinden zich meestal in het kerninterieur,
,waar ze deel uitmaken van euchromatische regio’s en transcriptionele hubs, terwijl inactieve en
heterochromatische gebieden vaak gelokaliseerd zijn aan de nucleaire periferie en verankerd zijn aan
de nucleaire lamina in de vorm van LADs. Deze perifere positionering draagt bij aan gensilencing en
genoomstabiliteit.
Deze ruimtelijke organisatie bevordert de vorming en stabiliteit van chromatineloops, TADs en A/B-
compartimenten. Door deze hiërarchische organisatie worden enhancer-promotor-interacties ruimtelijk
beperkt tot functionele domeinen, wat een nauwkeurige genregulatie mogelijk maakt en foutieve
genactivatie voorkomt. Op het hoogste niveau nemen chromoosmen vaste chromosoomterritoria in,
waardoor ongewenste interchromosomale contacten worden beperkt.
De nucleaire organisatie is dynamisch en kan veranderen tijdens differentiatie of in respons op signalen,
waardoor genexpressieprogramma’s aangepast worden aan de functionele toestand van de cel. De positie
van DNA in de nucleus bepaalt dus in sterke mate genregulatie en celfunctie.
Hoe kan mechanische stress zorgen voor 3D genoomorganisatie?
Mechanische stress kan de 3D-organisatie van het genoom beïnvloeden doordat fysieke krachten uit de
celomgeving worden doorgegeven aan de celkern en daar de ruimtelijke organisatie van chromatine
veranderen, zonder dat er DNA-mutaties nodig zijn.
Cellen ervaren mechanische krachten zoals rek, compressie en shear stress, afkomstig van de
extracellulaire matrix, celadhesie en celmigratie. Deze krachten worden doorgegeven via het cytoskelet
(actinefilamenten, microtubuli en intermediaire filamenten) naar de nucleus via het LINC-complex. In dit
complex verbinden nesprine-eiwitten (aan de buitenzijde van de kern) het cytoskelet met SUN-eiwitten
(aan de binnenzijde van de nucleaire envelop).
Vanuit het LINC-complex worden krachten overgebracht op de nucleaire lamina, een netwerk van lamine-
aiwitten dat de kern vorm en mechanische stabiliteit geeft. De nucleaire lamina staat in direct contact met
chromatine, met name via LADs. Hierdoor kunnen mechanische krachten leiden tot:
- Vervorming van de kern
- Verandering in chromatinecompactie (euchromatine « heterochromatine)
- Herschikking van TADs en LADs, waardoor genoomregio’s van positie veranderen binnen de kern
Deze ruimtelijke herschikking kan enhancer-promotor-interacties wijzigen en zo leiden tot aangepaste
genexpressieprogramma’s, bijvoorbeeld tijdens migratie, differentiatie of in tumoren onder fysieke druk.
Verklaar ziektebeeld Progeria.
Progeria (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome) is een zeldzaam genetisch verouderingssyndroom dat
wordt veroorzaakt door een mutatie in het LMNA-gen op chromosoom 1. Dit gen codeert voor de nucleaire
lamines lamine A en C, structurele eiwitten van de nucleaire lamina die essentieel zijn voor kernvorm,
mechanische stabiliteit en 3D-genoomorganisatie.
Bij Progeria veroorzaakt een puntmutatie (G608G) in het LMNA-gen het ontstaan van een cryptische
splice site. Hierdoor wordt een abnormale, verkorte vorm van lamine A geproduceerd: progerine.
Progerine mist een deel dat normaal nodig is voor correcte verwerking en blijft permanent gefarnesyleerd,
waardoor het zich opstapelt in de nucleaire lamina.
De accumulatie van progerine verstoort de structuur van de nucleaire envelop, wat leidt tot een
gerimpelde en vervormde celkern (nuclear blebbing) en verlies van kernelasticiteit. Doordat de nucleaire
,lamina beschadigd is, kunnen LADs niet meer goed aan de lamina verankeren. Hierdoor raakt de 3D-
genoomorganisatie ontregeld, inclusief de positionering van heterochromatine en de organisatie van
TADs (LADs soort van vervangen door TADs).
Deze structurele en organisatorische verstoringen leiden tot foutieve genexpressie, verhoogde DNA-
schade, verminderde DNA-reparatie en replicatiestress, wat resulteert in versnelde cellulaire
veroudering.
Klinisch uit zich dit in een vroegtijdig verouderingsfenotype, met groeiachterstand, verlies van subcutaan
vet, skeletafwijkingen en vooral ernstige cardiovasculaire aandoeningen, die de belangrijkste
doordsoorzaak zijn bij patiënten met Progeria.
Verklaar de rol van chromatineveranderingen in nucleaire fluïditeit en fasescheiding.
Chromatineveranderingen spelen een centrale rol in het bepalen van de nucleaire fluïditeit en de fase-
scheiding binnen de celkern. De nucleus is geen homogeen vloeibaar compartiment, maar bestaat uit
regio’s met verschillende fysische eigenschappen (zoals viscositeit en elasticiteit), die rechtstreeks
worden bepaald door de condensatietoestand en chemie van chromatine.
Chromatine en nucleaire fluïditeit
De mate van chromatinecondensatie beïnvloedt hoe vrij moleculen zich binnen de kern kunnen bewegen:
- Euchromatine
o Minder gecondenseerd
o Rijk aan histonacetylaties
o Relatief hydrofiel
o Hoge mobiliteit van chromatine en nucleaire eiwitten
o Zorgt voor een meer vloeibare (liquid-like) nucleaire omgeving en actieve genexpressie
- Heterochromatine
o Sterk gecondenseerd
o Verrijkt in histonmethylaties (bv H3K9me3)
o Bindt eiwitten zoals HP1
o Relatief minder dynamisch
o Creëert een meer stijve en minder fluïde (solid-like) nucleaire omgeving en genrepressie
Chromatine en fase-scheiding
Verschillen in chromatine-eigenschappen leiden tot liquid-liquid phase seperation (LLPS) in de kern.
Hierdoor ontstaan membraanloze nucleaire compartimenten, waarin specifieke eiwitten en
nucleïnezuten worden geconcentreerd.
- Actief, euchromatisch chromatine associeert met hydrofiele fasen, zoals het A-compartiment
en met nucleaire speckles.
- Repressief, heterochromatisch chromatine clustert in repressieve fasen, zoals het B-
compartiment en LADs aan de nucleaire periferie.
Nucleaire speckles als voorbeeld
Nucleaire speckles zijn dynamische, fase-gescheiden condensaten rijk aan RNA-processingfactoren
(zoals splicingfactoren). Ze fungeren als assemblage- en opslagplaatsen voor transcriptie- en
splicingmechinerie. Actieve genen en euchromatine-lussen positioneren zich vaak aan de rand van
, speckles, wat efficiënte RNA-verwerking bevordert. Speckles kunnen fuseren, fragmenteren en van grootte
veranderen, wat bijdraagt aan de dynamiek en fluïditeit van de nucleus.
TADs, LADs en 3D-organisatie
- TADs zijn structurele luseenheden waarvan de interne interacties gevoelig zijn voor epigenetische
veranderingen.
- LADs zijn typisch heterochromatisch, minder fluïde en gelokaliseerd aan de nucleaire lamina.
- Veranderingen in histonmodificaties kunnen LADs losmaken van de lamina en verplaatsen naar
het meer fluïde nucleoplasma, vaak gepaard met genactivatie.
Bespreek/interpreteer 3C-HiC TAD afbeelding.
Hi-C is een genome-wide uitbreiding van de Chromosome Conformation Capture (3C)-technologie en
meet fysieke contactfrequenties tussen alle genomische loci in de celkern. DNA-regio’s die in 3D dicht
bij elkaar liggen, worden na fixatie, digestie en ligatie samen gesequenced. De resultaten worden
weergegeven als een contactmatrix (heatmap).
(Uitvoering (niet gevraagd):
1. Crosslinking (fixatie): formaldehyde
a. Formaldehyde vormt covalente bindingen tussen DNA & eiwitten (histonen, CTCF,
cohesin), en tussen eiwitten onderling
b. Hierdoor wordt de 3D-chromatinestructuur ‘bevroren’ op het moment van fixatie
c. DNA-regio’s die fysiek dicht bij elkaar liggen (lussen, TAD-interacties) blijven gekoppeld
2. Restrictie-digest: gefixeerde chromatine wordt geknipt met een restrictie-enzym
a. Knipt DNA op specifieke herkenningsplaatsen
b. Creëert korte DNA-fragmenten
c. Fragmenten die in 3D dicht bij elkaar lagen, blijven via crosslinks bij elkaar
3. End-fill en labeling (specifiek voor Hi-C)
a. De DNA-uiteinden worden:
i. Opgevuld (end-fill)
ii. Gelabeld met biotine-gemodificeerde nucleotiden
b. Hierdoor kunnen later echte ligatie-junctions selectief worden verrijkt
4. Ligatie (verdunning!) à DNA-ligatie gebeurt onder sterk verdunde omstandigheden
a. Doel: intramoleculaire ligatie bevorderen
b. DNA-uiteinden die door crosslinking dicht bij elkaar liggen, worden aan elkaar geligeerd
c. Resultaat:
i. Eén DNA-fragment dat twee oorspronkelijk ver uit elkaar liggende loci bevat
ii. Dit fragment representeert een fysiek contact in de nucleus
5. Crosslink reversal & DNA-zuivering
a. Crosslinks worden verwijderd
b. Eiwitten verdwijnen
c. DNA blijft achter met ligatie-producten die 3D-interacties coderen
6. Fragmentatie & verrijking (Hi-C)
a. DNA wordt verder gefragmenteerd (sonicatie)
b. Biotine-gelabelde fragmenten worden geïsoleerd met streptavidine-beads
c. Enkel echte Hi-C contacten blijven over
7. Sequencing (NGS)
a. Fragmenten worden klaargemaakt voor NGS
