ZELFSTUDIE: TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN GENETISCHE VARIANTEN
SANGER SEQUENCING
BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
- Methode voor DNA sequencing
- Elektroforese betrokken & gebaseerd op willekeurige opname van ketenbeëindigende
dideoxynucleotiden door DNA-polymerase tijdens in vitro DNA-replicatie
- Makkelijk uitvoerbaar
- Speciale PCR gevolgd door gelelktroforese
o Speciale PCR: toevoeging DNA, DNA-polymerase, DNA-nucleotiden, primers &
dideoxynucleotiden
o Dideoxynucleotide = lijkt normaal nucleottide maar geen OH-groep op 3’-uiteinde
=> DNA replicatie stopt
o Aan elke dideoxynucleotide kleurstof gebonden => fluoresceert
- Na replicatie ontstaan gelabelde DNA-fragmenten verschillend in lengte
- Dmv gelelktroforese fragmenten scheiden op lengte
o Gel = netwerk van vezels die moleculaire zeef vormen
o DNA negatief geladen dus bewegen in gel naar positieve pool zodra spanning op gel wordt
gezet => hoe kleiner fragment, hoe sneller ze bewegen ing el
- Op niveau van genoom & transcriptoom
- Gouden standaard
MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS
TOEPASSINGEN
- Nauwkeurige analyse 1 of enkele genen
- Valideren resultaten grootschalige sequencing (bv NGS)
- Opsporen specifieke mutaties voor genetische screening
- Genetische variaties onderzoeken die invloed hebben op medicijnreacties
Standaard methode voor detecteren van vaianten van 1nucleotide & kleine inserties/deleties
VOOR- & NADELEN
Nadelen
- Beperkt aantal genen
- Beperkt aantal patiënten
1
,Voordelen
- Sensitiviteit = 100% & hoge nauwkeurigheid
- Kosteneffectief voor kleinschalige projecten
- Lange leeslengtes
WAAROM WEL/NIET GESCHIKT VOOR BEPAALDE PROCEDURE
Wel geschikt
- Kleine DNA-fragmenten (tot 1.000bp)
- Bekende & gerichte regios
- Variantverificatie of kwaliteitscontrole
- Kleine aantallen monsters
MASSIVE PARALLELE DNA SEQUENCING: WHOLE EXOME SEQUENCING
BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
- Sequencen van alle eiwitcoderende regio’s van genen in een genoom
o = exonen = 1,2% van genoom
o Meeste bekende ziekteveroorzakende mutaties hier aanwezig
- 2stappen
o Selecteren deel DNA dat eiwitten codeert = exonen
o Sequencen exon-DNA mbv high-throughput DNA-sequencingtechnologie
Stap 1
- Microarrays = enkelstrengige oligonucleotiden met sequentie uit mensleijk genoom
=> gebied van belang aan oppervlak bedekken
- Genomisch DNA geknipt om dubbelstrengs fragmenten te vormen
o Fragementen ondergaan eindherstel
o Adapters met universele primingsequenties toegevoegd
o Fragmenten worden gehybridiseerd met oligo’s op microarray
niet-gehydridiseerde worden weggewassen => gewenste worden geëlueerd
o Fragmenten daarna geamplificieerd mbv PCR
Stap 2
- Short-read-NGS-systemen zijn geschikt voor analyseren van relatief korte stukken DNA-sequentie
=> zoals in menselijk genoom voorkomen
2
,MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS
TOEPASSINGEN
- Sequencing op genoom niveau => exonen
- SNV’s, indels & kleine CNVs => kleine genetische varianten
- DNA-test gebruikt om eiwitcoderende delen van genen te analyseren & oorzaak genetische
aandoeningen achterhalen
- Diagnose van onbekende of heterogene syndromen
identificeren oorzaken specifieke ziektes
& opsporen erfelijke varianten in onbekende gevallen
Zowel in academisch onderzoek als bij klinische diagnostiek
Vooral bij patiënten met onduidelijk ziektebeeld, ziektebeeld met groot aantal ziekte veroorzakende
genen & ziektebeeld waarvoor nog geen ziekte veroorzakende genen gekend zijn
VOOR- & NADELEN
Voordelen
- Groot aantal gekende ziekteveroorzakende genen
- Minder data te analysern => eenvoudigere interpretatie
- Ideaal voor diagnostiek van erfelijke ziekten
Nadelen
- Onduidelijk fenotype
- Mist varianten in niet-coderende regio’s
- Beperkte sensitiviteit
- Kan RNA-splicing of regulatieproblemen missen
- Grote kost door dure kis & vele werkuren
3
, WAAROM WEL/NIET GESCHIKT VOOR BEPAALDE PROCEDURE
- Effectief bij onderzoek naar zeldzame mendeliaanse ziekten
=> efficiënte manier om genetische varianten in alle genen v/e individu te identificeren
- Vaak aanvulling op andere test
o Mutaties vinden in genen waarvan al bekend is dat ze ziekten veroorzaken
o Nieuwe genen identificeren door exomen van patiënten met vergelijkbare kenmerken te
vergelijken
MASSIVA PARALLELE DNA SEQUENCING: WHOLE GENOME SEQUENCING
BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
Massieve parallele DNA-sequencing = next generation sequencing
- Alle DNA fragmenten in sample kunnen tegelijkertijd gesequenced worden
=> geen gelelektroforese nodig
=> betere output
- Volledige chromosomale DNA v/e organisme gesequenced
=> ook DNA mitochondriën & chloroplasten
- 2 verschillende soorten
o Start DNA sequentie eerst geamplificeerd met PCR
o Singel molecule sequencing
- Sequencing reactie gemonitord terwijl elke nucleotide wordt toegevoegd bij DNA synthese
o = sequencing-by-synthesis
- Leest volledige DNA van organisme
o Intronen, exonen, promotors & repetitieve gebieden
MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS
4
SANGER SEQUENCING
BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
- Methode voor DNA sequencing
- Elektroforese betrokken & gebaseerd op willekeurige opname van ketenbeëindigende
dideoxynucleotiden door DNA-polymerase tijdens in vitro DNA-replicatie
- Makkelijk uitvoerbaar
- Speciale PCR gevolgd door gelelktroforese
o Speciale PCR: toevoeging DNA, DNA-polymerase, DNA-nucleotiden, primers &
dideoxynucleotiden
o Dideoxynucleotide = lijkt normaal nucleottide maar geen OH-groep op 3’-uiteinde
=> DNA replicatie stopt
o Aan elke dideoxynucleotide kleurstof gebonden => fluoresceert
- Na replicatie ontstaan gelabelde DNA-fragmenten verschillend in lengte
- Dmv gelelktroforese fragmenten scheiden op lengte
o Gel = netwerk van vezels die moleculaire zeef vormen
o DNA negatief geladen dus bewegen in gel naar positieve pool zodra spanning op gel wordt
gezet => hoe kleiner fragment, hoe sneller ze bewegen ing el
- Op niveau van genoom & transcriptoom
- Gouden standaard
MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS
TOEPASSINGEN
- Nauwkeurige analyse 1 of enkele genen
- Valideren resultaten grootschalige sequencing (bv NGS)
- Opsporen specifieke mutaties voor genetische screening
- Genetische variaties onderzoeken die invloed hebben op medicijnreacties
Standaard methode voor detecteren van vaianten van 1nucleotide & kleine inserties/deleties
VOOR- & NADELEN
Nadelen
- Beperkt aantal genen
- Beperkt aantal patiënten
1
,Voordelen
- Sensitiviteit = 100% & hoge nauwkeurigheid
- Kosteneffectief voor kleinschalige projecten
- Lange leeslengtes
WAAROM WEL/NIET GESCHIKT VOOR BEPAALDE PROCEDURE
Wel geschikt
- Kleine DNA-fragmenten (tot 1.000bp)
- Bekende & gerichte regios
- Variantverificatie of kwaliteitscontrole
- Kleine aantallen monsters
MASSIVE PARALLELE DNA SEQUENCING: WHOLE EXOME SEQUENCING
BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
- Sequencen van alle eiwitcoderende regio’s van genen in een genoom
o = exonen = 1,2% van genoom
o Meeste bekende ziekteveroorzakende mutaties hier aanwezig
- 2stappen
o Selecteren deel DNA dat eiwitten codeert = exonen
o Sequencen exon-DNA mbv high-throughput DNA-sequencingtechnologie
Stap 1
- Microarrays = enkelstrengige oligonucleotiden met sequentie uit mensleijk genoom
=> gebied van belang aan oppervlak bedekken
- Genomisch DNA geknipt om dubbelstrengs fragmenten te vormen
o Fragementen ondergaan eindherstel
o Adapters met universele primingsequenties toegevoegd
o Fragmenten worden gehybridiseerd met oligo’s op microarray
niet-gehydridiseerde worden weggewassen => gewenste worden geëlueerd
o Fragmenten daarna geamplificieerd mbv PCR
Stap 2
- Short-read-NGS-systemen zijn geschikt voor analyseren van relatief korte stukken DNA-sequentie
=> zoals in menselijk genoom voorkomen
2
,MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS
TOEPASSINGEN
- Sequencing op genoom niveau => exonen
- SNV’s, indels & kleine CNVs => kleine genetische varianten
- DNA-test gebruikt om eiwitcoderende delen van genen te analyseren & oorzaak genetische
aandoeningen achterhalen
- Diagnose van onbekende of heterogene syndromen
identificeren oorzaken specifieke ziektes
& opsporen erfelijke varianten in onbekende gevallen
Zowel in academisch onderzoek als bij klinische diagnostiek
Vooral bij patiënten met onduidelijk ziektebeeld, ziektebeeld met groot aantal ziekte veroorzakende
genen & ziektebeeld waarvoor nog geen ziekte veroorzakende genen gekend zijn
VOOR- & NADELEN
Voordelen
- Groot aantal gekende ziekteveroorzakende genen
- Minder data te analysern => eenvoudigere interpretatie
- Ideaal voor diagnostiek van erfelijke ziekten
Nadelen
- Onduidelijk fenotype
- Mist varianten in niet-coderende regio’s
- Beperkte sensitiviteit
- Kan RNA-splicing of regulatieproblemen missen
- Grote kost door dure kis & vele werkuren
3
, WAAROM WEL/NIET GESCHIKT VOOR BEPAALDE PROCEDURE
- Effectief bij onderzoek naar zeldzame mendeliaanse ziekten
=> efficiënte manier om genetische varianten in alle genen v/e individu te identificeren
- Vaak aanvulling op andere test
o Mutaties vinden in genen waarvan al bekend is dat ze ziekten veroorzaken
o Nieuwe genen identificeren door exomen van patiënten met vergelijkbare kenmerken te
vergelijken
MASSIVA PARALLELE DNA SEQUENCING: WHOLE GENOME SEQUENCING
BESCHRIJF DE TECHNIEK/PROCEDURES MET ALLE TECHNISCHE DETAILS
Massieve parallele DNA-sequencing = next generation sequencing
- Alle DNA fragmenten in sample kunnen tegelijkertijd gesequenced worden
=> geen gelelektroforese nodig
=> betere output
- Volledige chromosomale DNA v/e organisme gesequenced
=> ook DNA mitochondriën & chloroplasten
- 2 verschillende soorten
o Start DNA sequentie eerst geamplificeerd met PCR
o Singel molecule sequencing
- Sequencing reactie gemonitord terwijl elke nucleotide wordt toegevoegd bij DNA synthese
o = sequencing-by-synthesis
- Leest volledige DNA van organisme
o Intronen, exonen, promotors & repetitieve gebieden
MAAK EEN SCHAMATISCHE TEKENING MET WEERGAVE VAN DE BELANGRIJKSTE
TECHNISCHE DETAILS
4
