V OORBEREIDINGSVRAGEN PRACTICUM 1
Deel 1: enzymen algemeen en LDH in het bijzonder
1. Hoe kunnen enzymen de reactiesnelheid verhogen?
Enzymen versnellen reacties door de activeringsenergie te verlagen.
2. Welke reactie wordt door LDH gekatalyseerd en welke rol speelt deze reactie in
het metabolisme?
Pyruvaat + NADH + H⁺ → Lactaat + NAD⁺
De cel heeft NAD⁺ nodig om energie (ATP) te blijven maken uit glucose, vooral als
er geen zuurstof is.
3. Wat is een ‘co-enzym’ en welk molecuul is voor LDH een co-enzym?
Een co-enzym is een klein organisch molecuul dat het enzym helpt bij zijn werking.
Voor LDH is NAD⁺/NADH het co-enzym.
4. Wat gebruik je in de experimenten van BCH21P als ‘maatstaf’ van LDH activiteit?
Je gebruikt de afname van NADH bij 340 nm. Dus hoe sneller de absorbantie daalt,
hoe sneller LDH werkt.
Kort gezegd: je kijkt naar hoe snel NADH verdwijnt om te weten hoe actief LDH is.
5. Welke soort activiteitsmeting is dat (continu/discontinu, direct/indirect)?
Continu, want je volgt de absorbantie tijdens de reactie in de spectrofotometer.
Indirect, want je meet niet direct het lactaat, maar de verandering van NADH.
6. Waarom verdun je bij de activiteitsmeting in experiment 1.2 je CVE tot je een
absorbantieafname van 0,1-0,2 per minuut krijgt?
Je verdunt je CVE zodat de reactie langzaam genoeg is om nauwkeurig te meten.
Deel 2: overzicht experimenten gehele cursus
, In dit practicum verzamel je door de weken heen met verschillende experimenten steeds
meer informatie over activiteit, kinetiek, en substraatspecificiteit van LDH. Je moet vaak
materiaal van één practicum bewaren voor volgende practica. Onderstaande opdracht is
bedoeld om je een overzicht te geven over het gehele practicum.
7. Hieronder zie je een tabel van ALLE experimenten die je in deze cursus uit gaat
voeren. Gebruik de cursuswijzer om deze tabel in te vullen.
Experiment Welke methoden Wat voor informatie Welke materialen uit eerdere
pas je toe? over de LDH reactie of experimenten heb je nodig?
zuivering levert dit op?
1.1 Centrifugeren + Je maakt een celvrij Hartweefsel, koude Tris-buffer
maken CVE extract met oplosbare
eiwitten
1.2 LDH-activiteit Of LDH actief is en CVE uit 1.1, Tris-buffer, NADH,
meten met hoeveel activiteit het pyruvaat
spectrofotometer CVE bevat
2.1 Eiwitzuivering met Scheiding van eiwitten Gefilterd CVE uit 1.1, Tris-buffers
HiTrap-kolom op lading
2.2 LDH-activiteit Bepaalt in welke fracties Fracties uit 2.1, reagentia uit 1.2
meten in fracties LDH zit
3 Bradford- Meet eiwitgehalte → Gefilterd CVE + fracties uit 2.1
eiwitbepaling berekening specifieke
activiteit en zuivering
4.1 SDS-PAGE (gel- Controleert zuiverheid Fracties met LDH, CVE
elektroforese) en grootte van LDH
4.2 Buffer maken Voorbereiding HPLC- Glaswerk, chemicaliën
(fosfaat-citraat) metingen
5 Enzymkinetiek Bepaalt KM, Vmax en CVE, buffers, pyruvaat, NADH,
(Michaelis– effect van remmer oxamaat
Menten + oxamaat
remming)
6 HPLC-analyse Controle van Reactiemonsters uit 5, buffer uit 4.2
van LDH-reacties NADH/NAD+ en
NADPH/NADP+ → co-
enzymspecificiteit
Deel 1: enzymen algemeen en LDH in het bijzonder
1. Hoe kunnen enzymen de reactiesnelheid verhogen?
Enzymen versnellen reacties door de activeringsenergie te verlagen.
2. Welke reactie wordt door LDH gekatalyseerd en welke rol speelt deze reactie in
het metabolisme?
Pyruvaat + NADH + H⁺ → Lactaat + NAD⁺
De cel heeft NAD⁺ nodig om energie (ATP) te blijven maken uit glucose, vooral als
er geen zuurstof is.
3. Wat is een ‘co-enzym’ en welk molecuul is voor LDH een co-enzym?
Een co-enzym is een klein organisch molecuul dat het enzym helpt bij zijn werking.
Voor LDH is NAD⁺/NADH het co-enzym.
4. Wat gebruik je in de experimenten van BCH21P als ‘maatstaf’ van LDH activiteit?
Je gebruikt de afname van NADH bij 340 nm. Dus hoe sneller de absorbantie daalt,
hoe sneller LDH werkt.
Kort gezegd: je kijkt naar hoe snel NADH verdwijnt om te weten hoe actief LDH is.
5. Welke soort activiteitsmeting is dat (continu/discontinu, direct/indirect)?
Continu, want je volgt de absorbantie tijdens de reactie in de spectrofotometer.
Indirect, want je meet niet direct het lactaat, maar de verandering van NADH.
6. Waarom verdun je bij de activiteitsmeting in experiment 1.2 je CVE tot je een
absorbantieafname van 0,1-0,2 per minuut krijgt?
Je verdunt je CVE zodat de reactie langzaam genoeg is om nauwkeurig te meten.
Deel 2: overzicht experimenten gehele cursus
, In dit practicum verzamel je door de weken heen met verschillende experimenten steeds
meer informatie over activiteit, kinetiek, en substraatspecificiteit van LDH. Je moet vaak
materiaal van één practicum bewaren voor volgende practica. Onderstaande opdracht is
bedoeld om je een overzicht te geven over het gehele practicum.
7. Hieronder zie je een tabel van ALLE experimenten die je in deze cursus uit gaat
voeren. Gebruik de cursuswijzer om deze tabel in te vullen.
Experiment Welke methoden Wat voor informatie Welke materialen uit eerdere
pas je toe? over de LDH reactie of experimenten heb je nodig?
zuivering levert dit op?
1.1 Centrifugeren + Je maakt een celvrij Hartweefsel, koude Tris-buffer
maken CVE extract met oplosbare
eiwitten
1.2 LDH-activiteit Of LDH actief is en CVE uit 1.1, Tris-buffer, NADH,
meten met hoeveel activiteit het pyruvaat
spectrofotometer CVE bevat
2.1 Eiwitzuivering met Scheiding van eiwitten Gefilterd CVE uit 1.1, Tris-buffers
HiTrap-kolom op lading
2.2 LDH-activiteit Bepaalt in welke fracties Fracties uit 2.1, reagentia uit 1.2
meten in fracties LDH zit
3 Bradford- Meet eiwitgehalte → Gefilterd CVE + fracties uit 2.1
eiwitbepaling berekening specifieke
activiteit en zuivering
4.1 SDS-PAGE (gel- Controleert zuiverheid Fracties met LDH, CVE
elektroforese) en grootte van LDH
4.2 Buffer maken Voorbereiding HPLC- Glaswerk, chemicaliën
(fosfaat-citraat) metingen
5 Enzymkinetiek Bepaalt KM, Vmax en CVE, buffers, pyruvaat, NADH,
(Michaelis– effect van remmer oxamaat
Menten + oxamaat
remming)
6 HPLC-analyse Controle van Reactiemonsters uit 5, buffer uit 4.2
van LDH-reacties NADH/NAD+ en
NADPH/NADP+ → co-
enzymspecificiteit
