Moleculaire Biologie
Verschil mutant en GGO GGO is kunstmatig gemodificeerd en kan zich
vermenigvuldigen waarbij genetisch gemodificeerd materiaal wordt doorgegeven
aan volgende generaties.
College 1 – 6/1/2025 “Y2H”
Y2H = yeast-two-hybrid
Wat is de functie van genX ?
Voor de functie van veel eiwitten is een
interactie noodzakelijk met 1 of meerdere
andere eiwitten.
BIJVOORBEELD: transcriptie initiërend
eiwitcomplex.
De interactie van je onbekende eiwit (dat gecodeerd wordt door genX) met een
bekend eiwit geeft informatie over de mogelijke functie ervan. Wanneer genX
interactie heeft met een ander eiwit in gist zullen ze dus waarschijnlijk betrokken
zijn bij hetzelfde proces.
De yeast-two-hybrid methode:
- Is gebaseerd op het transcriptie eiwit Gal4 dat zorgt voor
activatie/expressie van het gen dat codeert voor Gal1.
- Gal4 is een transcriptiefactor met 2 domeinen: het DNA bindingsdomein
(BD) en transcriptie activatiedomein (AD).
- Gal4 bindt aan de promoter van Gal1 op de Gal4 bindingsplaats. De Gal1
promoter is gelegen in het 5’ upstream gebied van een reporter of selectie
gen.
- Het Gal4-BD en Gal4-AD hoeven niet per sé in hetzelfde eiwit te zitten om
functioneel te zijn; maar ze moeten wel in hetzelfde eiwitcomplex zitten.
Hoe doe je dit? Met behulp van fusie
eiwitten.
- Door fusie eiwitten Q of X te
combineren met Gal4-BD en fusie
eiwit Y met Gal4-AD.
- Q en Y binden niet aan elkaar dus
GEEN expressie.
- X en Y binden wel aan elkaar dus
het Gal4 eiwit complex is heel en kan
binden aan de Gal4 bindingsplaats. Er
is dus WEL expressie.
Y2H in de praktijk:
- In een gist cel bevinden zich 2 plasmiden.
, - Plasmide 1 codeert voor een fusie-eiwit bestaande uit Gal4-BD en eiwit X
(X-BD=bait).
- Plasmide 2 codeert voor een fusie-eiwit bestaande uit Gal4-AD en eiwit Y
(Y-AD=prey).
- Gist met beide plasmiden kan groeien op selectieplaten zonder TRP en LEU
(selectiemarkers).
- Bait en Prey binden (interactie).
BD en AD in 1 complex
Actieve transcriptiefactor
- Transcriptiefactor bindt aan
promoter van reporter/selectie gen
en de UAS (upstream activation
sequence); interactie met RNA
polymerase.
- Expressie van reporter/selectie gen
Stappen Y2H (practicum):
- Plasmiden moeten coderen voor fusie
eiwitten.
- Fusie eiwitten moeten aan elkaar binden en
zorgen voor expressie van het reportergen
HIS.
- Genen zijn gemuteerd zodat er
geselecteerd kan worden op: aanwezigheid
van de plasmiden (TRP en LEU) en op de
interactie van X en Y (HIS).
Eisen gist stam voor Y2H:
,In ons practicum is Y = BMH2 en X = per tafel anders. Gal4bd-X plasmiden zullen
tijdens het practicum worden gekloneerd. Deze zullen in gist cellen
getransformeerd worden waar het Gal4ad-BMH2 plasmide, het his3 reporter-gen
en de 3 mutaties trp1, leu2 en his3 al aanwezig zijn.
Belangrijke onderdelen plasmide:
- ColE1 ORI = origin of
replication for E. coli want
hier worden de gekloneerde
plasmiden in
getransformeerd.
- Yeast 2µ ORI = origin of
replication voor gist want als
de plasmiden correct zijn
worden ze hier in
getransformeerd.
- AmpR = ampicilline
resistentiegen om te
selecteren op aanwezigheid
van plasmiden in E. coli.
- TRP1 = selectiemarker voor gist
- Gal4BD = codeert voor DNA bindend domein van Gal4, inclusief ADH1
promoter zodat deze tot expressie kan komen.
- MCS (polylinker) = stukje synthetisch DNA met meerdere restrictie ‘sites’
waar mbv restrictie enzymen genX in gekloneerd zal worden.
Reading frame fusie eiwit:
- Reading frame van BD deel in plasmide is bekend.
- Zoek reading frame van gen (Rad24) mbv start codon.
- Maak fusie en bepaal reading frame (mbv tripletten).
- Is reading frame correct na klonering in gebruikte site.
- Zoek stopcodon (TGA, TAG, TAA).
- HIER: stopcodon van vector wordt gebruikt.
De gistcellen worden uitgeplaat op verschillende selectieplaten ter controle van:
- Aanwezigheid van beide plasmiden: selectie op trp en leu: dus plaat met
adenine, lysine en histidine ZONDER trp en leu.
, Als hier kolonies op groeien weet je dat de plasmiden aanwezig zijn,
want gistcellen zonder de plasmiden zijn gemuteerd op deze genen en
zullen niet kunnen groeien op de plaat.
- Aanwezigheid van beide plasmiden EN interactie tussen de fusie eiwitten:
dus plaat met adenine en lysine ZONDER trp, leu en his.
Als hier kolonies op groeien weet je dat er ook interactie heeft
plaatsgevonden tussen de fusie eiwitten want dan hebben deze het
reporter gen HIS geactiveerd.
Hoe de resultaten er uit moeten zien:
BMH2 codeert voor 14-3-3 eiwitten. Deze eiwitten zijn erg belangrijk want ze zijn
in alle organismen geconserveerd en zijn betrokken bij veel cellulaire processen.
OEFENVRAAG: Kan het voorkomen dat een fusie eiwit van het activatiedomein
(AD) met een onbekend eiwit genX, activatie geeft van het selectiegen His zonder
BD-fusie-eiwit (bait)?
ANTWOORD: ja dit kan voorkomen, want als het onbekende genX
bijvoorbeeld codeert voor een DNA bindend domein (BD) en die zou
gaan binden aan de promoter van het selectiegen HIS, kan deze
geactiveerd worden.
Daarom moet je altijd een controle doen zonder BD-bait als je met een
onbekend gen werkt.
College 2 “Kloneren” – 7/1/2025
plasmid = vector
Restrictie enzymen Onderdeel
van restrictie/modifictie systeem
dat bacteriën beschermt tegen
Verschil mutant en GGO GGO is kunstmatig gemodificeerd en kan zich
vermenigvuldigen waarbij genetisch gemodificeerd materiaal wordt doorgegeven
aan volgende generaties.
College 1 – 6/1/2025 “Y2H”
Y2H = yeast-two-hybrid
Wat is de functie van genX ?
Voor de functie van veel eiwitten is een
interactie noodzakelijk met 1 of meerdere
andere eiwitten.
BIJVOORBEELD: transcriptie initiërend
eiwitcomplex.
De interactie van je onbekende eiwit (dat gecodeerd wordt door genX) met een
bekend eiwit geeft informatie over de mogelijke functie ervan. Wanneer genX
interactie heeft met een ander eiwit in gist zullen ze dus waarschijnlijk betrokken
zijn bij hetzelfde proces.
De yeast-two-hybrid methode:
- Is gebaseerd op het transcriptie eiwit Gal4 dat zorgt voor
activatie/expressie van het gen dat codeert voor Gal1.
- Gal4 is een transcriptiefactor met 2 domeinen: het DNA bindingsdomein
(BD) en transcriptie activatiedomein (AD).
- Gal4 bindt aan de promoter van Gal1 op de Gal4 bindingsplaats. De Gal1
promoter is gelegen in het 5’ upstream gebied van een reporter of selectie
gen.
- Het Gal4-BD en Gal4-AD hoeven niet per sé in hetzelfde eiwit te zitten om
functioneel te zijn; maar ze moeten wel in hetzelfde eiwitcomplex zitten.
Hoe doe je dit? Met behulp van fusie
eiwitten.
- Door fusie eiwitten Q of X te
combineren met Gal4-BD en fusie
eiwit Y met Gal4-AD.
- Q en Y binden niet aan elkaar dus
GEEN expressie.
- X en Y binden wel aan elkaar dus
het Gal4 eiwit complex is heel en kan
binden aan de Gal4 bindingsplaats. Er
is dus WEL expressie.
Y2H in de praktijk:
- In een gist cel bevinden zich 2 plasmiden.
, - Plasmide 1 codeert voor een fusie-eiwit bestaande uit Gal4-BD en eiwit X
(X-BD=bait).
- Plasmide 2 codeert voor een fusie-eiwit bestaande uit Gal4-AD en eiwit Y
(Y-AD=prey).
- Gist met beide plasmiden kan groeien op selectieplaten zonder TRP en LEU
(selectiemarkers).
- Bait en Prey binden (interactie).
BD en AD in 1 complex
Actieve transcriptiefactor
- Transcriptiefactor bindt aan
promoter van reporter/selectie gen
en de UAS (upstream activation
sequence); interactie met RNA
polymerase.
- Expressie van reporter/selectie gen
Stappen Y2H (practicum):
- Plasmiden moeten coderen voor fusie
eiwitten.
- Fusie eiwitten moeten aan elkaar binden en
zorgen voor expressie van het reportergen
HIS.
- Genen zijn gemuteerd zodat er
geselecteerd kan worden op: aanwezigheid
van de plasmiden (TRP en LEU) en op de
interactie van X en Y (HIS).
Eisen gist stam voor Y2H:
,In ons practicum is Y = BMH2 en X = per tafel anders. Gal4bd-X plasmiden zullen
tijdens het practicum worden gekloneerd. Deze zullen in gist cellen
getransformeerd worden waar het Gal4ad-BMH2 plasmide, het his3 reporter-gen
en de 3 mutaties trp1, leu2 en his3 al aanwezig zijn.
Belangrijke onderdelen plasmide:
- ColE1 ORI = origin of
replication for E. coli want
hier worden de gekloneerde
plasmiden in
getransformeerd.
- Yeast 2µ ORI = origin of
replication voor gist want als
de plasmiden correct zijn
worden ze hier in
getransformeerd.
- AmpR = ampicilline
resistentiegen om te
selecteren op aanwezigheid
van plasmiden in E. coli.
- TRP1 = selectiemarker voor gist
- Gal4BD = codeert voor DNA bindend domein van Gal4, inclusief ADH1
promoter zodat deze tot expressie kan komen.
- MCS (polylinker) = stukje synthetisch DNA met meerdere restrictie ‘sites’
waar mbv restrictie enzymen genX in gekloneerd zal worden.
Reading frame fusie eiwit:
- Reading frame van BD deel in plasmide is bekend.
- Zoek reading frame van gen (Rad24) mbv start codon.
- Maak fusie en bepaal reading frame (mbv tripletten).
- Is reading frame correct na klonering in gebruikte site.
- Zoek stopcodon (TGA, TAG, TAA).
- HIER: stopcodon van vector wordt gebruikt.
De gistcellen worden uitgeplaat op verschillende selectieplaten ter controle van:
- Aanwezigheid van beide plasmiden: selectie op trp en leu: dus plaat met
adenine, lysine en histidine ZONDER trp en leu.
, Als hier kolonies op groeien weet je dat de plasmiden aanwezig zijn,
want gistcellen zonder de plasmiden zijn gemuteerd op deze genen en
zullen niet kunnen groeien op de plaat.
- Aanwezigheid van beide plasmiden EN interactie tussen de fusie eiwitten:
dus plaat met adenine en lysine ZONDER trp, leu en his.
Als hier kolonies op groeien weet je dat er ook interactie heeft
plaatsgevonden tussen de fusie eiwitten want dan hebben deze het
reporter gen HIS geactiveerd.
Hoe de resultaten er uit moeten zien:
BMH2 codeert voor 14-3-3 eiwitten. Deze eiwitten zijn erg belangrijk want ze zijn
in alle organismen geconserveerd en zijn betrokken bij veel cellulaire processen.
OEFENVRAAG: Kan het voorkomen dat een fusie eiwit van het activatiedomein
(AD) met een onbekend eiwit genX, activatie geeft van het selectiegen His zonder
BD-fusie-eiwit (bait)?
ANTWOORD: ja dit kan voorkomen, want als het onbekende genX
bijvoorbeeld codeert voor een DNA bindend domein (BD) en die zou
gaan binden aan de promoter van het selectiegen HIS, kan deze
geactiveerd worden.
Daarom moet je altijd een controle doen zonder BD-bait als je met een
onbekend gen werkt.
College 2 “Kloneren” – 7/1/2025
plasmid = vector
Restrictie enzymen Onderdeel
van restrictie/modifictie systeem
dat bacteriën beschermt tegen
