Uitgebreid Labjournaal Celbiologie (45+ pagina’s): Corticosteron en glucocorticoïdreceptor-translocatie

2425 Celbiologie Practicum Psychobiologie

Invloed van corticosteron op de translocatie van het humane
glucocorticoïde receptor naar de celkern in humane cellen



Datum: 19-03-2025

Naam student:

Studentnummer:

(ABV)groepsnummer:

Na(a)m(en) practicumbegeleider(s):




1

,VOORBEREIDING SUBKLONEREN
Datum dagdelen:
4 februari 2025, dagdeel 1
6 februari 2025, dagdeel 2
12 februari 2025, dagdeel 3

PROEFOPZET

o Doel van dit deelexperiment:
4 februari 2025, dagdeel 1: Het vermeerderen van hGR DNA door middel van de
PCR-techniek.

6 februari 2025, dagdeel 2: Het zuiveren van DNA, om er zo voor te zorgen dat
alleen hGR overblijft. Hierna hebben we ook de restrictiedigestie uitgevoerd.

12 februari 2025, dagdeel 3: Gelektroforese uitvoeren en dan DNA extraheren.

o Controles / experimentele condities
4 februari 2025, dagdeel 1:
- 1x enkele digests Xhoi naam + naam
- 1x enkele digest BamHI naam + naam
- 1x ongeknipt hgr naam + naam
- 1x ongeknipt eGFP naam + naam
- Negatieve controle (zonder DNA, kijken wat er met de controle groep gebeurt). Dit
is de no-template control.

6 februari 2025, dagdeel 2:
- 1x enkele digests Xhoi naam + naam
- 1x enkele digest BamHI naam + naam
- 1x ongeknipt hgr naam + naam
- 1x ongeknipt eGFP naam + naam

12 februari 2025, dagdeel 3:
- 1x enkele digests Xhoi naam + naam
- 1x enkele digest BamHI naam + naam
- 1x ongeknipt hgr naam + naam
- 1x ongeknipt eGFP naam + naam




2

,o Bondig stappenplan
4 februari 2025, dagdeel 1:
1. Primers rondom HGR zetten en toevoeging van DNA primers;
2. Nucleotiden worden gebonden, zodat amplificatie kan plaatsvinden;
3. Door warmte vindt er denaturatie plaats.

6 februari 2025, dagdeel 2
1. Verdun het PCR-product tot 100 µL, voeg een gelijke hoeveelheid binding buffer toe
en vortex;
2. Breng het mengsel op de spinkolom, centrifugeer en was twee keer met wasbuffer
(500 µL en 200 µL);
3. Elueer het DNA door 25 µL elutiebuffer toe te voegen, incuberen en centrifugeren;
4. Het gezuiverde DNA bevindt zich nu in het 1.5 mL epje en is klaar voor verdere
analyse.

12 februari 2025, dagdeel 3
1. Epje gewogen voor uitgesneden agarose gel en erna;
2. 100 µL binding buffer per 100 mg gel toegevoegd. Vortex en incubeer bij 56°C tot
de gel volledig is opgelost;
3. Breng de oplossing op de spinkolom, centrifugeer en was twee keer met wasbuffer
(500 µL en 200 µL), gevolgd door centrifugeren;
4. Elueer het DNA door 25 µL elutiebuffer toe te voegen, incuberen en centrifugeren;
5. Herhaal dit om de opbrengst te maximaliseren. Het gezuiverde DNA bevindt zich
nu in het 1.5 mL epje en is klaar voor verdere analyse.

o Belangrijkste benodigdheden

4 februari 2025, dagdeel 1:
§ Forward T7 primer: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (0.2uM)
§ Reverse T3 primer: 5'-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3' (0.2uM)
§ DNA template (pBluescript plasmide) 100ng/ul
§ PCR cocktail:
§ Phusion DNA polymerase
§ Phusion buffer
§ dNTPs
§ MgCl2
§ H2O (nuclease free)

6 februari 2025, dagdeel 2:
§ Pipetpunten
§ Pipet
§ MQ water
§ Vortex

3

, § Spinkolom
§ Tafelcentrifuge
§ 10x Fast digest buffer
§ Expressieplasmide pEGFP-C1
§ Tafelcentrifuge
§ Waterbad
§ Hitteblok

12 februari 2025, dagdeel 3

§ MQ water
§ Vortex
§ Midorigreen
§ Spinkolom
§ 10x Fast digest buffer
§ Expressieplasmide pEGFP-C1
§ Tafelcentrifuge
§ Waterbad
§ Beschermkap
§ LED-bak
§ 2.0 mL epje
§ Weegschaal
§ Pipetpunten
§ Pipet
§ Hitteblok
§ Tafelcentrifuge

o Veiligheidsoverwegingen
4 februari 2025, dagdeel 1:
- Er werden geen risicovolle handelingen uitgevoerd tijdens dagdeel 1.

6 februari 2025, dagdeel 2
- Gebruik van bindingsbuffer, je wil niet dat je eigen DNA eraan bindt. Handschoenen
dragen;
- De hitteblok is heet, dus er moest worden opgepast.

12 februari 2025, dagdeel 3
- Bij de TAE buffer moet je met de onverdunde versie handschoenen dragen;
- Bij midorigreen handschoenen dragen, zodat je DNA er niet aan bindt en het
proces vervuilt.




4