,
,
,
,
,
,EXAMENVRAGEN HISTOLOGIE
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je
met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor
deze methoden en waarom?
Lichtmicroscopie
Werking:
• Maakt gebruik van zichtbaar licht
• Wordt gebruikt om de cellulaire structuur van een weefsel te bestuderen
bv: haren, bloedcellen, bacteriën
• Heeft kleine resolutie: +/- 0,2 µm
Voorbewerking:
STAP 1: 2 mogelijkheden
• Invriezen
○ Zeer snel
○ Enkel geschikt voor kleine weefselstukken
○ Structuur van eiwitten blijft ongewijzigd
○ Enzymactiviteit wordt vertraagd, maar wel bewaard (dus kan terugkomen wanneer het terug op
lichaamstemperatuur komt)
○ DNA en RNA bewaard
• Fixeren
○ Weefsel onderdompelen in fixator (formol)
○ Trager proces
○ Enzymactiviteit verloren
○ DNA en RNA beschadigd
Na invriezen kan het materiaal direct aangesneden worden.
Na fixatie kan nog niet meteen gesneden worden want het materiaal is nog te zacht.
Tussenstappen na fixatie:
• Al het water uit materiaal halen door in alcohol oplossingen te plaatsen met oplopende
concentratiegradiënt
• Materiaal inbedden in paraffine (is hydrofoob dus zou nooit mengen met water, daarom dus eerst water
verwijderen)
• Wanneer paraffine hard is geworden, kan het materiaal aangesneden worden
STAP 2: snijden in coupes met microtoom (dikte van 3-10 µm)
STAP 3: kleuring
Waarom
Doel is om weefsels zoveel mogelijk in oorspronkelijke toestand te bewaren. Hiervoor moeten afbraakprocessen
afgeremd worden. Deze afbraakprocessen komen op gang door een gebrek aan aanvoer van zuurstof, een gebrek
aan afvoer van afbraakproducten en door het vrijkomen van verteringsenzymen. Dit kan afgeremd worden door te
fixeren of in te vriezen. De keuze tussen deze twee hangt af van de aard van het weefsel.
, Transmissie elektronenmicroscopie
Werking:
• Maakt gebruik van een bundel elektronen: deze elektronen worden door een preparaat heen geschoten en
opgevangen op een gevoelige plaat. Op plaatsen waar het preparaat het dikst is, zullen er minder
elektronen door kunnen, wat voor een donkere zone op de gevoelige plaat zorgt.
• Om specifieke moleculen te bestuderen, wordt er ook gebruik gemaakt van immunolabeling (antistoffen
met goudlabels)
• Vergroting tot 1 miljoen keer of groter
• Grote resolutie: +/- 0,1 nm
dit is beter dan lichtmicroscopie en komt doordat versnelde elektronen een kleinere golflengte hebben
dan fotonen
• Wordt gebruikt om intracellulaire structuren te bestuderen
bv: organellen, membranen, virussen, ribosomen, DNA, glucose
Voorbewerking:
STAP 1:
1e fixatie met glutaaraldehyde
2e fixatie met OsO4
de te fixeren weefselfragmenten mogen max 1-2mm groot zijn, anders zal de fixatie niet goed lukken
STAP 2: De fixeerde weefsels inbedden in een hard materiaal, epoxyhars
STAP3: Zeer dunne coupes aansnijden (0,5-1 µm) met diamantmes of glasmes (want epoxyhars is te hard voor
microtoom)
Waarom:
Als je weefsels gaat bekijken, dan zal het weefselverval goed zichtbaar zijn, en dat maakt het te onderzoeken
weefsel minder goed beoordeelbaar. Er treedt osmotische zwelling op van mitochondria en endoplasmatisch
reticulum. Dit kan je vermijden door een goede en snelle fixatie.
,
,
,
,
,EXAMENVRAGEN HISTOLOGIE
1. Vergelijk conventionele lichtmicroscopie met de transmissie elektronenmicroscopie (TEM). Wat kan je
met beide technieken onderzoeken? Hoe moet het te onderzoeken weefsel voorbewerkt worden voor
deze methoden en waarom?
Lichtmicroscopie
Werking:
• Maakt gebruik van zichtbaar licht
• Wordt gebruikt om de cellulaire structuur van een weefsel te bestuderen
bv: haren, bloedcellen, bacteriën
• Heeft kleine resolutie: +/- 0,2 µm
Voorbewerking:
STAP 1: 2 mogelijkheden
• Invriezen
○ Zeer snel
○ Enkel geschikt voor kleine weefselstukken
○ Structuur van eiwitten blijft ongewijzigd
○ Enzymactiviteit wordt vertraagd, maar wel bewaard (dus kan terugkomen wanneer het terug op
lichaamstemperatuur komt)
○ DNA en RNA bewaard
• Fixeren
○ Weefsel onderdompelen in fixator (formol)
○ Trager proces
○ Enzymactiviteit verloren
○ DNA en RNA beschadigd
Na invriezen kan het materiaal direct aangesneden worden.
Na fixatie kan nog niet meteen gesneden worden want het materiaal is nog te zacht.
Tussenstappen na fixatie:
• Al het water uit materiaal halen door in alcohol oplossingen te plaatsen met oplopende
concentratiegradiënt
• Materiaal inbedden in paraffine (is hydrofoob dus zou nooit mengen met water, daarom dus eerst water
verwijderen)
• Wanneer paraffine hard is geworden, kan het materiaal aangesneden worden
STAP 2: snijden in coupes met microtoom (dikte van 3-10 µm)
STAP 3: kleuring
Waarom
Doel is om weefsels zoveel mogelijk in oorspronkelijke toestand te bewaren. Hiervoor moeten afbraakprocessen
afgeremd worden. Deze afbraakprocessen komen op gang door een gebrek aan aanvoer van zuurstof, een gebrek
aan afvoer van afbraakproducten en door het vrijkomen van verteringsenzymen. Dit kan afgeremd worden door te
fixeren of in te vriezen. De keuze tussen deze twee hangt af van de aard van het weefsel.
, Transmissie elektronenmicroscopie
Werking:
• Maakt gebruik van een bundel elektronen: deze elektronen worden door een preparaat heen geschoten en
opgevangen op een gevoelige plaat. Op plaatsen waar het preparaat het dikst is, zullen er minder
elektronen door kunnen, wat voor een donkere zone op de gevoelige plaat zorgt.
• Om specifieke moleculen te bestuderen, wordt er ook gebruik gemaakt van immunolabeling (antistoffen
met goudlabels)
• Vergroting tot 1 miljoen keer of groter
• Grote resolutie: +/- 0,1 nm
dit is beter dan lichtmicroscopie en komt doordat versnelde elektronen een kleinere golflengte hebben
dan fotonen
• Wordt gebruikt om intracellulaire structuren te bestuderen
bv: organellen, membranen, virussen, ribosomen, DNA, glucose
Voorbewerking:
STAP 1:
1e fixatie met glutaaraldehyde
2e fixatie met OsO4
de te fixeren weefselfragmenten mogen max 1-2mm groot zijn, anders zal de fixatie niet goed lukken
STAP 2: De fixeerde weefsels inbedden in een hard materiaal, epoxyhars
STAP3: Zeer dunne coupes aansnijden (0,5-1 µm) met diamantmes of glasmes (want epoxyhars is te hard voor
microtoom)
Waarom:
Als je weefsels gaat bekijken, dan zal het weefselverval goed zichtbaar zijn, en dat maakt het te onderzoeken
weefsel minder goed beoordeelbaar. Er treedt osmotische zwelling op van mitochondria en endoplasmatisch
reticulum. Dit kan je vermijden door een goede en snelle fixatie.
