Les 1: Chromatografie, HPLC, ,GC en Van Deemter
- Mobiele fase bewegende fase eluens.
- Stationaire fase stilstaande fase kolom.
- De retentiemechanismen veroorzaakt de scheiding.
- Componenten in een mengsel verdelen zich over beide fasen.
Belangrijke termen:
- Solute opgeloste component.
- Solvent oplosmiddel.
- Solution oplossing.
- Elution elutie: vloeistof door een kolom leiden.
- Eluent vloeistof die door de kolom gaat waarmee geëlueerd wordt.
- Eluate vloeistof die de kolom uit komt: wat geëlueerd is.
- Retention time de tijd die nodig is totdat een solute geëlueerd is.
Tm = tijd van een onvertraagde component = tijd
van het verblijf in de mobiele fase (voor
componenten die wel vertraagd worden).
- Onvertraagde component heeft
helemaal geen affiniteit met de
stationaire fase de minimale tijd die
nodig is om een stof uit de kolom te laten
komen (is bij elke GC anders).
T’r = de netto retentietijd = retentietijd piek – tm.
Verschil absorptie en adsorptie.
- Absorptie iets gaat echt ergens in zitten.
- Adsorptie gaat een interactie aan.
- Verdeling
- Elektrostatische interactie
- Moleculaire zeefwerking
- Biologische affiniteit
Kolomchromatografie
- HPLC High Performance Liquid Chromatografie.
Hoge druk: 100-400 bar.
Scheiden van stoffen die niet vluchtig zijn in de vloeistof fase.
- UPLC
Hogere druk: 300-1000 bar.
Eluens ontgassen
- Filtreren en vacuüm. (let op het type filter)
- Trilbad.
- Helium doorlijden.
- On line: vacuüm.
- Verwarmen/refluxen (=soxhlet) (= meest efficiënte methode)
, HPLC injector
- Load sample gaat in de sampleloop, loopt
erdoorheen en gaat naar de waste.
Als heel de 20 ul loop gevuld wordt met 35 ul
vloeistof, wordt de loop gespoeld en de loop zit
vol.
- Inject de loop staat niet meer aangesloten
op de waste maar op de kolom.
De 20 ul wordt uit de loop geduwd naar de kolom.
Waarom moet je niet injecteren als de injector op inject gaat dan gaat alles naar de
waste.
Prefilter
- Bij injecteren in een HPLC systeem de oplossing vooraf filtreren.
- Filter plaatsen op een injectiespuit.
- Deze methode wordt gebruikt omdat er hele kleine deeltjesgrootte zijn, dit filter is vaak
afgestemd op de deeltjesgrootte van de kolom.
Kolom
- Guard kolom bescherming wanneer er kleine fouten gemaakt
worden dan kan alleen de guard kolom vervangen worden ipv heel de
kolom.
- Aluminium jacket zodat de kolom niet buigbaar is en dus voor
stevigheid.
- Kleine deeltjesgrootte van de kolom zorgt vaak voor een betere
scheiding.
- Hoe langer de kolom hoe langer de meting duurt. (meest gebruikt 15
mm) kortere kolom voor snellere analyse.
- Een kolom bestaat vaak uit silicaoxide.
Silicaoxide met een pH van boven de 8 en onder een pH van 2
hydrolyserend. Hierdoor raak je je stationaire fase kwijt. De
bindingen breken waardoor je kolom kapot gaat.
UV-detector
- Er zitten kwarts raampjes aan de zijkanen waar de stof even recht loopt.
Op dit punt wordt er gedetecteerd. (Zie afbeelding)
o Waar is de gevoeligheid van afhankelijk? door
lambert beer.
o Waarom wordt kwartslas gebruikt voor de detector?
voor de UV.
DAD-detector
- Diode Array Detector.
Meet bij meerdere golflengtes.
- Deze wordt gebruikt zodat je precies kan zien welke golflengtes
geabsorbeerd worden.
(Vaak bij drugs profilering)
- Mobiele fase bewegende fase eluens.
- Stationaire fase stilstaande fase kolom.
- De retentiemechanismen veroorzaakt de scheiding.
- Componenten in een mengsel verdelen zich over beide fasen.
Belangrijke termen:
- Solute opgeloste component.
- Solvent oplosmiddel.
- Solution oplossing.
- Elution elutie: vloeistof door een kolom leiden.
- Eluent vloeistof die door de kolom gaat waarmee geëlueerd wordt.
- Eluate vloeistof die de kolom uit komt: wat geëlueerd is.
- Retention time de tijd die nodig is totdat een solute geëlueerd is.
Tm = tijd van een onvertraagde component = tijd
van het verblijf in de mobiele fase (voor
componenten die wel vertraagd worden).
- Onvertraagde component heeft
helemaal geen affiniteit met de
stationaire fase de minimale tijd die
nodig is om een stof uit de kolom te laten
komen (is bij elke GC anders).
T’r = de netto retentietijd = retentietijd piek – tm.
Verschil absorptie en adsorptie.
- Absorptie iets gaat echt ergens in zitten.
- Adsorptie gaat een interactie aan.
- Verdeling
- Elektrostatische interactie
- Moleculaire zeefwerking
- Biologische affiniteit
Kolomchromatografie
- HPLC High Performance Liquid Chromatografie.
Hoge druk: 100-400 bar.
Scheiden van stoffen die niet vluchtig zijn in de vloeistof fase.
- UPLC
Hogere druk: 300-1000 bar.
Eluens ontgassen
- Filtreren en vacuüm. (let op het type filter)
- Trilbad.
- Helium doorlijden.
- On line: vacuüm.
- Verwarmen/refluxen (=soxhlet) (= meest efficiënte methode)
, HPLC injector
- Load sample gaat in de sampleloop, loopt
erdoorheen en gaat naar de waste.
Als heel de 20 ul loop gevuld wordt met 35 ul
vloeistof, wordt de loop gespoeld en de loop zit
vol.
- Inject de loop staat niet meer aangesloten
op de waste maar op de kolom.
De 20 ul wordt uit de loop geduwd naar de kolom.
Waarom moet je niet injecteren als de injector op inject gaat dan gaat alles naar de
waste.
Prefilter
- Bij injecteren in een HPLC systeem de oplossing vooraf filtreren.
- Filter plaatsen op een injectiespuit.
- Deze methode wordt gebruikt omdat er hele kleine deeltjesgrootte zijn, dit filter is vaak
afgestemd op de deeltjesgrootte van de kolom.
Kolom
- Guard kolom bescherming wanneer er kleine fouten gemaakt
worden dan kan alleen de guard kolom vervangen worden ipv heel de
kolom.
- Aluminium jacket zodat de kolom niet buigbaar is en dus voor
stevigheid.
- Kleine deeltjesgrootte van de kolom zorgt vaak voor een betere
scheiding.
- Hoe langer de kolom hoe langer de meting duurt. (meest gebruikt 15
mm) kortere kolom voor snellere analyse.
- Een kolom bestaat vaak uit silicaoxide.
Silicaoxide met een pH van boven de 8 en onder een pH van 2
hydrolyserend. Hierdoor raak je je stationaire fase kwijt. De
bindingen breken waardoor je kolom kapot gaat.
UV-detector
- Er zitten kwarts raampjes aan de zijkanen waar de stof even recht loopt.
Op dit punt wordt er gedetecteerd. (Zie afbeelding)
o Waar is de gevoeligheid van afhankelijk? door
lambert beer.
o Waarom wordt kwartslas gebruikt voor de detector?
voor de UV.
DAD-detector
- Diode Array Detector.
Meet bij meerdere golflengtes.
- Deze wordt gebruikt zodat je precies kan zien welke golflengtes
geabsorbeerd worden.
(Vaak bij drugs profilering)
