Zie examenvragen op het einde van elke powerpoint!!
HS1: NUCLEAIRE ORGANISATIE EN DE 3D GENOOMSTRUCTUUR
NUCLEAIRE COMPARTIMENTALISATIE
1,4m DNA wordt opgerold in 10
micrometer door gereguleerde
mechanismen
• Chromatine eiwitten
• Interacties tussen
opeenvolgende nucleosomen
Nucleosomen Opvouwing van de dubbele helix rond histonen (chromatine eiwitten)
-> zullen als magneten het DNA nog verder oprollen
! niet random !
Enhancer promotor Uit chromatinevezels van 30nm worden lussen gevormd die zorgen voor
loops verhoging van transcriptie door regulatorische gebieden in contact te
brengen met elkaar
=> CTCF en cohesine vormen en stabiliseren de loops
TAD domeinen ; topologically associated domains
= een pakket van lussen met DNA sequenties van genen die een
gemeenschappelijk doel hebben en in dit domein gecoreguleerd kunnen
worden, ookal liggen ze oorspronkelijk ver uit elkaar (centraal id nucleus)
! bevat actieve genen = euchromatine !
Regulatie door CTCF en Cohesine
! bij verstoring kan misregulatie van genen voorkomen door foute
enhancers (kanker) !
LAD domeinen ; lamine associated domains
= TAD domeinen die gekoppeld zijn aan de lamine-laag van de
nucleuswand (perifeer)
! bevat inactieve genen = heterochromatine !
Regulatie door nucleaire Lamine eiwitten
= eiwitten vormen een ankerplaats voor de lusstructuren, met uitzondering
van de nucleaire poor complexen
Compartimenten = groepjes TAD/LAD domeinen die dezelfde eigenschappen hebben
A) euchromatine = hydrofiel en actief DNA
B) heterochromatine = hydrofoob en inactief DNA
Chromosoomterritoria = elk chromosoom ligt apart, waarbij chromosomen met gelijkaardige
functies, interchromosomale contacten kunnen maken (chromosome
kissing)
,NUCLEAIRE FLUIDITEIT EN FASE-SCHEIDING (komt ook voor in mitochondrien)
NUCLEAIRE FLUIDITEIT
Embryogenese:
Om te kunnen differentieren naar een specifiek celtype, zullen
specifieke TADs en LADs zich organiseren waardoor de juiste
chromosoomregio’s samen actief zijn om een bepaald weefsel te
vormen
= een dynamisch proces
TAD en LAD domeinen verschillen in hydrofobiciteit
=> door histon modificaties kan de structuur van chromatine veranderen, gelinkt aan verandering in
genexpressie
TAD domeinen (hydrofiel) Acetylatie
= negatief geladen acetylgroep creert een hydrofiele omgeving
LAD domeinen (hydrofoob) Methylatie
= compactere hydrofobe omgeving wordt gecreerd waardoor repressie
van genen gebeurt
Lipidenkoppeling aan histonen
= vetzuurstaarten maken een hydrofobe omgeving
Een TAD domein verhuist van compartiment I -> II
Oorzaak: vb. door histon modificatie is het domein van
hydrofobiciteit veranderd
Gevolg: de promotorsequentie van de verhuisde TAD zal in een
hydrofiele context belanden waardoor RNA polymerase kan
binden (=> verandering in transcriptie activiteit)
CONCLUSIE: ! de nucleus is niet homogeen !
nucleaire fluiditeit zorgt dat lussen of domeinen (tijdelijk) van compartiment kunnen veranderen
afhankelijk van:
1. Histon modificaties
2. Interacties met CTCF en Cohesine
3. Mechanische stress op de kern
=> heeft allemaal effect op welke genen tot expressie komen
,FASE-SCHEIDING
= een proces waarbij moleculen zich groeperen op basis van hun chemische eigenschappen, waardoor
afzonderlijke “bubbels” of compartimenten ontstaan
Immunofluorescentie van TADs en LADs
Groen: euchromatine merker (TAD)
Rood: heterochromatine merker (LAD)
Kleuring op vlak van metabolisme
Wit: metabool actief (TAD)
Zwart: metabool inactief (LAD)
(cellen in een passieve slaapstand hebben meer inactieve domeinen)
GENOOM 3D OPVOUWING: TADS EN LADS
! Om genexpressie en genregulatie te begrijpen moeten we van de lineaire demensie naar 3D gaan !
=> hogere demensie regulatie van genfuncties, bepalend voor celdifferentiatie en organogenese
Driehoeks voorstelling
= weergave van de contacten die sequenties maken met
elkaar binnen een bepaald chromosoom (meestal sterk), of
interchromosomaal (vaak zwakker)
CTCF
= boundary of insulator element
; DNA bindend eiwit dat TAD domeinen afbakend
=> blokkeert zo chromatine complexen, waardoor verdere
euchromatine of heterochromatine omzetting tussen 2 TAD
domeinen wordt verhinderd
Cohesine
= een chromatine eiwit dat de chromatiden tijdens de G2 fase
van de celcyclus bij elkaar houdt
Cohesine uitschakeling:
=> verandering in intensiteit van de interacties
=> structuurverandering van de primaire TAD domeinen
! beide belangrijk tijdens de celcyclus !
=> heel de 3D organisatie en lusvorming moet opnieuw
geconstruceerd worden na DNA synthese
, CHROMOSOOM CONFORMATIE CAPTEER TECHNOLOGIE (3C TECHNOLOGIE)
!!EXAMEN!!
Doelen:
=> regulatie mechanismen in de cel in kaart brengen
=> verstoorde TAD organisaties terugvinden bij ziektes die op eerste zicht niet veroorzaakt worden door
een mutatie in coderende gebieden
!! uitvoering tijdens de celdeling kan info geven over de herorganisatie van chromatine !!
1. DNA sequentie van een chromosoom dat via ‘DNA binding proteins’ interageert met een andere
DNA sequentie (verder gelegen, of op een ander chromosoom)
--------- cross-linking met formaldehyde
2. De ‘DNA binding proteins’ worden ge-crosslinkt aan het DNA waardoor de lusorganisatie niet
meer kan veranderen
--------- knippen met restictie nuclease
3. DNA wordt geknipt waarbij sticky ends overblijven aan de uiteinden
--------- DNA ligation
4. T4 DNA ligase plakt de compatibele sticky ends aan:
-> elkaar (grote kans want dichtbij)
-> een andere molecule in de oplossing
=> vorming van kleine circulaire structuurtjes met kleine uiteindes
--------- verhitten op 65°C en proteolyse om de cross links te verwijderen
5. Het eiwit laat los van het DNA waardoor lineair DNA verkregen wordt met 2 probes
--------- sequencing
6. Bepalen welke chromosomen dit waren, en dus interageren met elkaar
=> een driehoek voorstelling wordt opgesteld
HS1: NUCLEAIRE ORGANISATIE EN DE 3D GENOOMSTRUCTUUR
NUCLEAIRE COMPARTIMENTALISATIE
1,4m DNA wordt opgerold in 10
micrometer door gereguleerde
mechanismen
• Chromatine eiwitten
• Interacties tussen
opeenvolgende nucleosomen
Nucleosomen Opvouwing van de dubbele helix rond histonen (chromatine eiwitten)
-> zullen als magneten het DNA nog verder oprollen
! niet random !
Enhancer promotor Uit chromatinevezels van 30nm worden lussen gevormd die zorgen voor
loops verhoging van transcriptie door regulatorische gebieden in contact te
brengen met elkaar
=> CTCF en cohesine vormen en stabiliseren de loops
TAD domeinen ; topologically associated domains
= een pakket van lussen met DNA sequenties van genen die een
gemeenschappelijk doel hebben en in dit domein gecoreguleerd kunnen
worden, ookal liggen ze oorspronkelijk ver uit elkaar (centraal id nucleus)
! bevat actieve genen = euchromatine !
Regulatie door CTCF en Cohesine
! bij verstoring kan misregulatie van genen voorkomen door foute
enhancers (kanker) !
LAD domeinen ; lamine associated domains
= TAD domeinen die gekoppeld zijn aan de lamine-laag van de
nucleuswand (perifeer)
! bevat inactieve genen = heterochromatine !
Regulatie door nucleaire Lamine eiwitten
= eiwitten vormen een ankerplaats voor de lusstructuren, met uitzondering
van de nucleaire poor complexen
Compartimenten = groepjes TAD/LAD domeinen die dezelfde eigenschappen hebben
A) euchromatine = hydrofiel en actief DNA
B) heterochromatine = hydrofoob en inactief DNA
Chromosoomterritoria = elk chromosoom ligt apart, waarbij chromosomen met gelijkaardige
functies, interchromosomale contacten kunnen maken (chromosome
kissing)
,NUCLEAIRE FLUIDITEIT EN FASE-SCHEIDING (komt ook voor in mitochondrien)
NUCLEAIRE FLUIDITEIT
Embryogenese:
Om te kunnen differentieren naar een specifiek celtype, zullen
specifieke TADs en LADs zich organiseren waardoor de juiste
chromosoomregio’s samen actief zijn om een bepaald weefsel te
vormen
= een dynamisch proces
TAD en LAD domeinen verschillen in hydrofobiciteit
=> door histon modificaties kan de structuur van chromatine veranderen, gelinkt aan verandering in
genexpressie
TAD domeinen (hydrofiel) Acetylatie
= negatief geladen acetylgroep creert een hydrofiele omgeving
LAD domeinen (hydrofoob) Methylatie
= compactere hydrofobe omgeving wordt gecreerd waardoor repressie
van genen gebeurt
Lipidenkoppeling aan histonen
= vetzuurstaarten maken een hydrofobe omgeving
Een TAD domein verhuist van compartiment I -> II
Oorzaak: vb. door histon modificatie is het domein van
hydrofobiciteit veranderd
Gevolg: de promotorsequentie van de verhuisde TAD zal in een
hydrofiele context belanden waardoor RNA polymerase kan
binden (=> verandering in transcriptie activiteit)
CONCLUSIE: ! de nucleus is niet homogeen !
nucleaire fluiditeit zorgt dat lussen of domeinen (tijdelijk) van compartiment kunnen veranderen
afhankelijk van:
1. Histon modificaties
2. Interacties met CTCF en Cohesine
3. Mechanische stress op de kern
=> heeft allemaal effect op welke genen tot expressie komen
,FASE-SCHEIDING
= een proces waarbij moleculen zich groeperen op basis van hun chemische eigenschappen, waardoor
afzonderlijke “bubbels” of compartimenten ontstaan
Immunofluorescentie van TADs en LADs
Groen: euchromatine merker (TAD)
Rood: heterochromatine merker (LAD)
Kleuring op vlak van metabolisme
Wit: metabool actief (TAD)
Zwart: metabool inactief (LAD)
(cellen in een passieve slaapstand hebben meer inactieve domeinen)
GENOOM 3D OPVOUWING: TADS EN LADS
! Om genexpressie en genregulatie te begrijpen moeten we van de lineaire demensie naar 3D gaan !
=> hogere demensie regulatie van genfuncties, bepalend voor celdifferentiatie en organogenese
Driehoeks voorstelling
= weergave van de contacten die sequenties maken met
elkaar binnen een bepaald chromosoom (meestal sterk), of
interchromosomaal (vaak zwakker)
CTCF
= boundary of insulator element
; DNA bindend eiwit dat TAD domeinen afbakend
=> blokkeert zo chromatine complexen, waardoor verdere
euchromatine of heterochromatine omzetting tussen 2 TAD
domeinen wordt verhinderd
Cohesine
= een chromatine eiwit dat de chromatiden tijdens de G2 fase
van de celcyclus bij elkaar houdt
Cohesine uitschakeling:
=> verandering in intensiteit van de interacties
=> structuurverandering van de primaire TAD domeinen
! beide belangrijk tijdens de celcyclus !
=> heel de 3D organisatie en lusvorming moet opnieuw
geconstruceerd worden na DNA synthese
, CHROMOSOOM CONFORMATIE CAPTEER TECHNOLOGIE (3C TECHNOLOGIE)
!!EXAMEN!!
Doelen:
=> regulatie mechanismen in de cel in kaart brengen
=> verstoorde TAD organisaties terugvinden bij ziektes die op eerste zicht niet veroorzaakt worden door
een mutatie in coderende gebieden
!! uitvoering tijdens de celdeling kan info geven over de herorganisatie van chromatine !!
1. DNA sequentie van een chromosoom dat via ‘DNA binding proteins’ interageert met een andere
DNA sequentie (verder gelegen, of op een ander chromosoom)
--------- cross-linking met formaldehyde
2. De ‘DNA binding proteins’ worden ge-crosslinkt aan het DNA waardoor de lusorganisatie niet
meer kan veranderen
--------- knippen met restictie nuclease
3. DNA wordt geknipt waarbij sticky ends overblijven aan de uiteinden
--------- DNA ligation
4. T4 DNA ligase plakt de compatibele sticky ends aan:
-> elkaar (grote kans want dichtbij)
-> een andere molecule in de oplossing
=> vorming van kleine circulaire structuurtjes met kleine uiteindes
--------- verhitten op 65°C en proteolyse om de cross links te verwijderen
5. Het eiwit laat los van het DNA waardoor lineair DNA verkregen wordt met 2 probes
--------- sequencing
6. Bepalen welke chromosomen dit waren, en dus interageren met elkaar
=> een driehoek voorstelling wordt opgesteld
