Les 1 basisbegrippen voor scheidingsmethode
Dingen scheiden omdat je 1 specifiek ding wilt hebben. Denk bijv uit insuline uit bacteriën te
zuiveren.
Zuivertechniek is chromatografie
Hierbij wordt er gebruik gemaakt van 2 fase (niet mengbaar):
1. Stationaire fase (eluaat)
Vast of vloeibaar. Bijv. glazen kolom. (Staat stil)
2. Mobiele fase (eluens)
Vloeibaar of gas. Loopt langs de stationaire fase
Principe chromatografie: Stoffen met een hoge affiniteit voor de stationaire fase komen
vertraagd van de kolom.
Voorbeeld chromatografie. Hij mag niet stoppen met lopen en het is belangrijk dat je
vloeistof blijft toevoegen aan de bovenkant.
- Preparatief chromatografie
je wilt iets prepareren (klaar maken voor iets)
- Analytische chromatografie
Je wilt ergens achter komen
,Chromatografische systemen
- Dunnelaagchromatografie
- Elektroforese
- Kolom chromatografie
Papier/ dunne laag chromatografie
TLC plaat, glazenplaat met een vaste fase (stationaire fase) erop.
Onder in je loopvloeistof (mobiele fase) die trekt omhoog en neemt je sample mee.
Afhankelijk van wat erin zit worden de stoffen gescheden. Belangrijk dat er een deksel op zit
ivm vluchtige vloeistoffen.
Adsorptie chromatografie:
Men kunt referentiewaarde op stellen tegen je te onderzoeken stoffen of je kijkt naar de
loopsnelheden van bepaalde stoffen.
afstand afgelegd door stof
R F=
afstand afgelegd door oplosmiddel
afstand afgelegd door stof
R x=
afstand afgelegd door referentie
,Kolom chromatografie
Reservaat met mobiele fase
Kolom materiaal wordt tegengehouden met glaswol.
Diffusie is een probleem bij deze methode: Hoe langer iets in de kolom hoe
slechter de scheiding. (diffusie = spreiding).
HPLC en FPLC werken onder hoge druk die helpen bij het voorkomen van
diffusie.
voorbeeld HPLC. Filter zorgt ervoor dat je alleen de vloeistof pakt en geen
lucht/gas. (lucht is een probleem)
Verschil HPLC en FPLC
HPLC=
- hoge druk
- Geschikt voor kleine moleculen
FPLC
- Lagere druk
- Grotere moleculen die intact moeten blijven.
Gas chromatografie
Mobiele fase is een gas, stationaire fase is wss een
vloeistof.
, Read out (chromatogram)
Chromatogram = output van je chromatogram.
To = dodentijd
Tr = bruto retentietijd
T ‘r = Tr-To = netto retentietijd
Retentietijd is de tijd tussen de top van je piek en de start van je experiment.
Dodentijd is de tijd totdat je vloeistof erdoorheen is gekomen.
Piekhoogte en Piekbreedte maken samen de oppervlakte van de grafiek en geeft de
hoeveelheid van een stof weer.
Als de piek heel breedte dan is de scheiding minder goed. Verschil in retentie tijden geeft
ook een slechtere scheiding.
selectiviteit: verschil in retentietijd.
t b−t 0
Selectiviteit α=
t a−t 0
Resolutie: verhouding tussen de breedte en
verschil in tijd. (Verschil in tijden: groot verschil
in tijden = hogere resolutie / verschil in breedte:
hoe smaller = betere resolutie)
2(t a−t b )
Resolutie R=
W a+W b
(dit geeft weer hoe goed 2 stoffen worden gescheiden)
Hoge schotelgetal = een betere scheiding (geeft de efficiëntie van je kolom weer.)
*Hoe hoger de resolutie hoe beter de scheiding*
Hoe kun je efficiëntie van je kolom vergroten:
Dingen scheiden omdat je 1 specifiek ding wilt hebben. Denk bijv uit insuline uit bacteriën te
zuiveren.
Zuivertechniek is chromatografie
Hierbij wordt er gebruik gemaakt van 2 fase (niet mengbaar):
1. Stationaire fase (eluaat)
Vast of vloeibaar. Bijv. glazen kolom. (Staat stil)
2. Mobiele fase (eluens)
Vloeibaar of gas. Loopt langs de stationaire fase
Principe chromatografie: Stoffen met een hoge affiniteit voor de stationaire fase komen
vertraagd van de kolom.
Voorbeeld chromatografie. Hij mag niet stoppen met lopen en het is belangrijk dat je
vloeistof blijft toevoegen aan de bovenkant.
- Preparatief chromatografie
je wilt iets prepareren (klaar maken voor iets)
- Analytische chromatografie
Je wilt ergens achter komen
,Chromatografische systemen
- Dunnelaagchromatografie
- Elektroforese
- Kolom chromatografie
Papier/ dunne laag chromatografie
TLC plaat, glazenplaat met een vaste fase (stationaire fase) erop.
Onder in je loopvloeistof (mobiele fase) die trekt omhoog en neemt je sample mee.
Afhankelijk van wat erin zit worden de stoffen gescheden. Belangrijk dat er een deksel op zit
ivm vluchtige vloeistoffen.
Adsorptie chromatografie:
Men kunt referentiewaarde op stellen tegen je te onderzoeken stoffen of je kijkt naar de
loopsnelheden van bepaalde stoffen.
afstand afgelegd door stof
R F=
afstand afgelegd door oplosmiddel
afstand afgelegd door stof
R x=
afstand afgelegd door referentie
,Kolom chromatografie
Reservaat met mobiele fase
Kolom materiaal wordt tegengehouden met glaswol.
Diffusie is een probleem bij deze methode: Hoe langer iets in de kolom hoe
slechter de scheiding. (diffusie = spreiding).
HPLC en FPLC werken onder hoge druk die helpen bij het voorkomen van
diffusie.
voorbeeld HPLC. Filter zorgt ervoor dat je alleen de vloeistof pakt en geen
lucht/gas. (lucht is een probleem)
Verschil HPLC en FPLC
HPLC=
- hoge druk
- Geschikt voor kleine moleculen
FPLC
- Lagere druk
- Grotere moleculen die intact moeten blijven.
Gas chromatografie
Mobiele fase is een gas, stationaire fase is wss een
vloeistof.
, Read out (chromatogram)
Chromatogram = output van je chromatogram.
To = dodentijd
Tr = bruto retentietijd
T ‘r = Tr-To = netto retentietijd
Retentietijd is de tijd tussen de top van je piek en de start van je experiment.
Dodentijd is de tijd totdat je vloeistof erdoorheen is gekomen.
Piekhoogte en Piekbreedte maken samen de oppervlakte van de grafiek en geeft de
hoeveelheid van een stof weer.
Als de piek heel breedte dan is de scheiding minder goed. Verschil in retentie tijden geeft
ook een slechtere scheiding.
selectiviteit: verschil in retentietijd.
t b−t 0
Selectiviteit α=
t a−t 0
Resolutie: verhouding tussen de breedte en
verschil in tijd. (Verschil in tijden: groot verschil
in tijden = hogere resolutie / verschil in breedte:
hoe smaller = betere resolutie)
2(t a−t b )
Resolutie R=
W a+W b
(dit geeft weer hoe goed 2 stoffen worden gescheiden)
Hoge schotelgetal = een betere scheiding (geeft de efficiëntie van je kolom weer.)
*Hoe hoger de resolutie hoe beter de scheiding*
Hoe kun je efficiëntie van je kolom vergroten:
