Eiwit onderzoek
- Sommige methoden zijn voor meerdere onderzoeken geschikt, maar niet allemaal.
Analytische methoden
- Doel: kwalitatief en kwantitatief onderzoek; welk eiwit is aanwezig en hoeveel is
daarvan aanwezig
Gelelektroforese
- Scheiding op lading en vorm/grootte
- v = (E x z) : f
- Snelheid = (sterkte elektrisch veld x lading eiwit) : wrijvingscoëfficiënt
- Dragermateriaal: polyacrylamide; moleculaire zeef. Dichtheid bepaalt welke grootte
eiwitten er doorheen kunnen lopen
- Verschillende typen gelektroforese:
SDS-PAGE
- Sodium dodecylsulfaat poly acryl gelelektroforese
- Het SDS denatureert de eiwitten, maakt het een lineaire vorm. Maakt de eiwitten
uniform negatief.
- Alleen scheiding op grootte
- β-mercatoethanol wordt gebruikt om zwavelbruggen te reduceren.
Iso-electric focussing (IEF)
- Polyacrylamide gel met pH gradiënt.
- Op het iso-elektrisch punt van het eiwit is de netto lading nul: het eiwit wordt net zo
hard naar - getrokken als naar +
-
2D elektroforese
- 1e dimensie IEF, 2e dimensie SDS-PAGE
- Van elk eiwit molmassa en iso-elektrisch punt kunnen bepalen
Preparatieve methoden
- Preparatieve methoden zijn gericht op het zuiveren van actief eiwit uit de cel/weefsel
- Eiwitten kunnen van elkaar gescheiden worden op basis van grootte, oplosbaarheid,
lading, bindingsaffiniteit
, - Doel: Het verkrijgen van een oplossing met een zo hoog mogelijke activiteit, met zo
min mogelijk verschillende eiwitten.
Dialyse: in- en uitzouten
- Principe: semi - permeabele membraan laat alleen kleine moleculen door
-
Gel-filtratie
- Kolom met gelbolletjes waar kleine eiwitten in kunnen binden. Je vangt fracties op.
De grote eiwitten komen als eerst uit de kolom.
-
Ionenwisselaar
- Eiwitten binden aan geladen gelbolletjes. De lading van het eiwit bepaalt de
bindingssterkte.
- Met een zoutgradiënt is de binding te verbreken: elutie
, -
(Ultra)-centrifugatie
- Met zeer hoge G krachten deeltjes scheiden.
- De sedimentatiesnelheid (bezinkingssnelheid) is afhankelijk van massa, vorm,
dichtheid van deeltje en dichtheid van oplossing.
-
- (^ gradiëntcentrifugatie)
Antilichamen
- Antilichamen worden gebruikt voor zuivering en detectie van eiwitten. Ze herkennen
een bepaald epitoop, die op een bepaald antigen zit.
- Een polyclonaal antilichaam zijn meerdere antilichamen die meerdere epitopen
herkennen.
- Een monoclonaal antilichaam is een zuiver antilichaam dat een type epitoop herkent.
- Monoclonale antilichamen hebben minder ‘contaminatie/vervuiling’, maar polyclonaal
herkent zelfde antigen in meerdere isovormen.
- Sommige methoden zijn voor meerdere onderzoeken geschikt, maar niet allemaal.
Analytische methoden
- Doel: kwalitatief en kwantitatief onderzoek; welk eiwit is aanwezig en hoeveel is
daarvan aanwezig
Gelelektroforese
- Scheiding op lading en vorm/grootte
- v = (E x z) : f
- Snelheid = (sterkte elektrisch veld x lading eiwit) : wrijvingscoëfficiënt
- Dragermateriaal: polyacrylamide; moleculaire zeef. Dichtheid bepaalt welke grootte
eiwitten er doorheen kunnen lopen
- Verschillende typen gelektroforese:
SDS-PAGE
- Sodium dodecylsulfaat poly acryl gelelektroforese
- Het SDS denatureert de eiwitten, maakt het een lineaire vorm. Maakt de eiwitten
uniform negatief.
- Alleen scheiding op grootte
- β-mercatoethanol wordt gebruikt om zwavelbruggen te reduceren.
Iso-electric focussing (IEF)
- Polyacrylamide gel met pH gradiënt.
- Op het iso-elektrisch punt van het eiwit is de netto lading nul: het eiwit wordt net zo
hard naar - getrokken als naar +
-
2D elektroforese
- 1e dimensie IEF, 2e dimensie SDS-PAGE
- Van elk eiwit molmassa en iso-elektrisch punt kunnen bepalen
Preparatieve methoden
- Preparatieve methoden zijn gericht op het zuiveren van actief eiwit uit de cel/weefsel
- Eiwitten kunnen van elkaar gescheiden worden op basis van grootte, oplosbaarheid,
lading, bindingsaffiniteit
, - Doel: Het verkrijgen van een oplossing met een zo hoog mogelijke activiteit, met zo
min mogelijk verschillende eiwitten.
Dialyse: in- en uitzouten
- Principe: semi - permeabele membraan laat alleen kleine moleculen door
-
Gel-filtratie
- Kolom met gelbolletjes waar kleine eiwitten in kunnen binden. Je vangt fracties op.
De grote eiwitten komen als eerst uit de kolom.
-
Ionenwisselaar
- Eiwitten binden aan geladen gelbolletjes. De lading van het eiwit bepaalt de
bindingssterkte.
- Met een zoutgradiënt is de binding te verbreken: elutie
, -
(Ultra)-centrifugatie
- Met zeer hoge G krachten deeltjes scheiden.
- De sedimentatiesnelheid (bezinkingssnelheid) is afhankelijk van massa, vorm,
dichtheid van deeltje en dichtheid van oplossing.
-
- (^ gradiëntcentrifugatie)
Antilichamen
- Antilichamen worden gebruikt voor zuivering en detectie van eiwitten. Ze herkennen
een bepaald epitoop, die op een bepaald antigen zit.
- Een polyclonaal antilichaam zijn meerdere antilichamen die meerdere epitopen
herkennen.
- Een monoclonaal antilichaam is een zuiver antilichaam dat een type epitoop herkent.
- Monoclonale antilichamen hebben minder ‘contaminatie/vervuiling’, maar polyclonaal
herkent zelfde antigen in meerdere isovormen.
