LabTools Theorie
Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en Gelfiltratie
Het is scheiden van stoffen is een belangrijk proces. Enerzijds om te analyseren waaruit een mengsel
bestaat (analytische scheiding) en anderzijds om stoffen, zoals eiwitten te isoleren voor verdere
toepassingen (preparatieve scheiding).
Chromatografie = een scheidingstechniek waarmee een mengsel van stoffen gescheiden kan worden
in individuele componenten.
Verdeling van componenten over 2 fasen, die niet met elkaar mengbaar zijn.
1. Stationaire fase (vast of vloeibaar)
Is de omhulling, bijvoorbeeld een glazen kolom. Stoffen met een hoge affiniteit voor de
stationaire fase komen vertraagd van de kolom.
2. Mobiele fase (vloeibaar of gas)
De stoffen, monster gaan hierin. De mobiele fase gaat langs de stationaire fase, waardoor de
stoffen met hoge affiniteit eruit gaan/vertraagd worden.
Preparatief = vloeistof waarvan je weet wat erin zit en wat er moet ontstaan.
Analytisch = vloeistof waarvan je niet weet wat erin zit of wat er moet ontstaan. Het maakt dan ook
niet uit of het kapot gaat of niet.
Er zijn verschillende typen chromatografische systemen
- Dunne laag chromatografie
De stationaire fase is een dunne laag absorberende materiaal bijvoorbeeld sillica gel. De mobiele fase
is een vloeistof en beweegt over de stationaire fase door capillaire werking. Dit is een goedkope en
makkelijke methode. Het is een bakje met een deksel. De samples worden op de vaste stationaire
fase gelegd. De samples lopen door het papier omhoog.
Berekening:
afstand afgelegd door stof
Rf =
afstand afgelegd door oplosmiddel
afstand afgelegd door stof
Rx=
afstand afgelegd door referentie
Rf is je monster. Rx zijn de referenties waarmee je de monster gaat vergelijken.
- Kolom chromatografie
De mobiele fase zit in een kolom. De stationaire fase zit rondom de kolom. Een probleem bij alle
kolomchromatiografische scheidingen is diffussie, waardoor de banden breder worden, dus scheiding
(R) minder. Bij hogere elutiesnelheid minder diffussie, dus betere scheiding. Daarom worden vaak
hoge-druk pompen gebruikt, wat speciale eisen stelt aan het dragermateriaal.
HPLC (high-performance liquid chromatography)
Hoge druk, componenten system bestand tegen druk
Vooral kleine biologische moleculen
, FPLC (fast protein liquid chromatography)
Lagere druk, componenten die geen eiwit-denaturatie veroorzaken
Grotere moleculen, zoals eiwitten
Gas chromatografie. Bij gas chromatografie is de mobiele fase een gas. Relatief weinig gebruikt in de
LS.
HPLC
Eluens, vloeistof: gradiënt mogelijk of isocratisch
Kolom: afhankelijk van type scheiding
Detectors: UV/VIS, fluorescentie, brekingsindex, elektrochemisch
Chromatogram: terminologie
Dodetijd/volume: de tijd/volume die nodig is voor de mobiele fase om de kolom te verlaten
Retentie tijd: de tijd tussen injecteren van het monster en het midden van de piek van het eluaat.
Met een chromatogram kan je zien of twee stoffen goed gescheiden kunnen worden.
Selectiviteit, hoe ver liggen de pieken uit elkaar. Hoe
dichterbij elkaar hoe lager de selectiviteit:
Tb−T 0
a=
Ta−T 0
Resolutie, het verschil van de pieken maar nu wordt de
piekbreedte ook mee genomen:
2 ( ta−tb )
R=
Wa+Wb
Schotel getal: de efficiëntie van een kolom. Het
schotelgetal is een maat voor de hoeveelheid pieken (schotels) die je goed gescheiden van elkaar van
een kolom kunt krijgen. Efficiëntie te verhogen door de lengte van de kolom te verlengen, de
kwaliteit van het kolom materiaal, de constante doorloopsnelheid.
De kwantitatieve analyse met het chromatogram. Hoe moet je bepalen hoeveel stof er is
geanalyseerd?
1. Externe standaardisatie
Piek oppervlakte (of hoogte) van concentratiereeks van standaard in losse runs ijklijn
2. Interne standaardisatie
Toevoegen van referentie-stof aan sample, die er niet van nature inzit. Bepaal de respons-
factor met standaarden. Met de verhouding tussen referentie-stof en je stof die je wilt
meten bepaal je de concentratie.
,Scheidingsprincipe
- Gelfiltratie
Gelfiltratie wordt gebruikt om eiwitten van verschillende grootte van elkaar te scheiden. Het principe
van gelfiltratie berust erop dat kleine eiwitten een langere weg door een poreuze matrix moeten
afleggen dan de grote eiwitten. Het gevolg is dat kleine eiwitten later van de kolom eluren (=van de
kolom afkomen) dan grote eiwitten. Eiwitten van verschillende grootte hebben dus een verschillende
hoeveelheid eluens (oplosmiddel/buffer) nodig om van de kolom te elueren. De verschillende eluties
worden aan het einde van de kolom in aparte buizen verzameld, zodat eiwitten van verschillende
grootte van elkaar worden gescheiden. De verschillende buizen worden vervolgens geanalyseerd op
de aanwezigheid van eiwitten en verder bewerkt.
Scheiding op basis van het moleculair gewicht; beads gedragen zich als een filter. Eerst gaan de grote
moleculen en daarna de kleinste moleculen. De grote moleculen kunnen de poriën van de bol niet in:
Elutie volume: Ve = V0
(Zeer) kleine moleculen kunnen alle poriën van de bol in:
Ve = V0 + Vi = Vz
Met de ijklijn kan je de molmassa uitrekenen met de gelfiltratie. Delta y : Delta x
, Les 2 Gelfiltratie en affiniteitschromatografie
Eiwitten
- Aminozuren
- Structuren
- Interacties
Aminozuren zijn opgebouwd uit aminogroepen en carboxylgroepen. Er zijn hydrofobe, aploaire,
aminozuren. De zij-groep heeft geen O/OH om water mee te binden. De hydrofiele, polaire,
aminozuren hebben een zij-groep met een O/OH groep.
Aromatische aminozuren zijn aminozuren met een ring, aromatische ringen. De aromatische
aminozuren zijn de hydrofobe Phenylalanine, Tryptophan en de hydrofiele Tyrosine. De
verontreiniging van DNA/RNA is een groot probleem, omdat ze een aromatische ring bevatten.
Naar hydrofobe en hydrofiele aminozuren zijn er ook zure en basische aminozuren. Een aminozuur is
uur als er een COO of COOH groep in zit. De basische aminozuren herkennen we aan de NH groep die
een plusje opneemt. De zuren aminozuren:
- Aspartic acid (Asp of D)
- Glutamic acid (Glu of E)
En de basische aminozuren zijn:
- Lysine (Lys of K)
- Arginine (Arg of R)
- Histidine (His of H)
Aminozuren kunnen aan elkaar gekoppeld worden door een peptide binding. H2O wordt afgesplitst
en er ontstaat een CONH, tussen de twee aminozuren.
Eiwitten kunnen interacties met elkaar gaan, maar wel tijdelijk. Welke krachten gebruiken eiwitten
om interacties met elkaar aan te gaan:
- Waterstofbruggen
- Hydrofobe interacties
- Vd Waals interacties
- Ionbinding
- Zwavelbruggen, ook covalent
- Andere covalente verbinden
De meeste van deze bindingen, behalve covalente verbinden, zijn tijdelijk. Ze kunnen binden en
weer loslaten. Transient = tijdelijk. Door de bindingen krijgen we een tijdelijke verandering in de
structuur activatie.
Primaire structuur = aminozuren. Met amino end en carboxy end.
Secondaire structuur = hydrogen bond. A helix
Tetraire structuur = hydrophobic interactions and van der waals interactions + ionic bond.
Polypeptide backbone.
Quaternaire structuur = a subunit, b subunit. Hemoglobine.
Les 1 Basisbegrippen voor scheidingsmethoden en Gelfiltratie
Het is scheiden van stoffen is een belangrijk proces. Enerzijds om te analyseren waaruit een mengsel
bestaat (analytische scheiding) en anderzijds om stoffen, zoals eiwitten te isoleren voor verdere
toepassingen (preparatieve scheiding).
Chromatografie = een scheidingstechniek waarmee een mengsel van stoffen gescheiden kan worden
in individuele componenten.
Verdeling van componenten over 2 fasen, die niet met elkaar mengbaar zijn.
1. Stationaire fase (vast of vloeibaar)
Is de omhulling, bijvoorbeeld een glazen kolom. Stoffen met een hoge affiniteit voor de
stationaire fase komen vertraagd van de kolom.
2. Mobiele fase (vloeibaar of gas)
De stoffen, monster gaan hierin. De mobiele fase gaat langs de stationaire fase, waardoor de
stoffen met hoge affiniteit eruit gaan/vertraagd worden.
Preparatief = vloeistof waarvan je weet wat erin zit en wat er moet ontstaan.
Analytisch = vloeistof waarvan je niet weet wat erin zit of wat er moet ontstaan. Het maakt dan ook
niet uit of het kapot gaat of niet.
Er zijn verschillende typen chromatografische systemen
- Dunne laag chromatografie
De stationaire fase is een dunne laag absorberende materiaal bijvoorbeeld sillica gel. De mobiele fase
is een vloeistof en beweegt over de stationaire fase door capillaire werking. Dit is een goedkope en
makkelijke methode. Het is een bakje met een deksel. De samples worden op de vaste stationaire
fase gelegd. De samples lopen door het papier omhoog.
Berekening:
afstand afgelegd door stof
Rf =
afstand afgelegd door oplosmiddel
afstand afgelegd door stof
Rx=
afstand afgelegd door referentie
Rf is je monster. Rx zijn de referenties waarmee je de monster gaat vergelijken.
- Kolom chromatografie
De mobiele fase zit in een kolom. De stationaire fase zit rondom de kolom. Een probleem bij alle
kolomchromatiografische scheidingen is diffussie, waardoor de banden breder worden, dus scheiding
(R) minder. Bij hogere elutiesnelheid minder diffussie, dus betere scheiding. Daarom worden vaak
hoge-druk pompen gebruikt, wat speciale eisen stelt aan het dragermateriaal.
HPLC (high-performance liquid chromatography)
Hoge druk, componenten system bestand tegen druk
Vooral kleine biologische moleculen
, FPLC (fast protein liquid chromatography)
Lagere druk, componenten die geen eiwit-denaturatie veroorzaken
Grotere moleculen, zoals eiwitten
Gas chromatografie. Bij gas chromatografie is de mobiele fase een gas. Relatief weinig gebruikt in de
LS.
HPLC
Eluens, vloeistof: gradiënt mogelijk of isocratisch
Kolom: afhankelijk van type scheiding
Detectors: UV/VIS, fluorescentie, brekingsindex, elektrochemisch
Chromatogram: terminologie
Dodetijd/volume: de tijd/volume die nodig is voor de mobiele fase om de kolom te verlaten
Retentie tijd: de tijd tussen injecteren van het monster en het midden van de piek van het eluaat.
Met een chromatogram kan je zien of twee stoffen goed gescheiden kunnen worden.
Selectiviteit, hoe ver liggen de pieken uit elkaar. Hoe
dichterbij elkaar hoe lager de selectiviteit:
Tb−T 0
a=
Ta−T 0
Resolutie, het verschil van de pieken maar nu wordt de
piekbreedte ook mee genomen:
2 ( ta−tb )
R=
Wa+Wb
Schotel getal: de efficiëntie van een kolom. Het
schotelgetal is een maat voor de hoeveelheid pieken (schotels) die je goed gescheiden van elkaar van
een kolom kunt krijgen. Efficiëntie te verhogen door de lengte van de kolom te verlengen, de
kwaliteit van het kolom materiaal, de constante doorloopsnelheid.
De kwantitatieve analyse met het chromatogram. Hoe moet je bepalen hoeveel stof er is
geanalyseerd?
1. Externe standaardisatie
Piek oppervlakte (of hoogte) van concentratiereeks van standaard in losse runs ijklijn
2. Interne standaardisatie
Toevoegen van referentie-stof aan sample, die er niet van nature inzit. Bepaal de respons-
factor met standaarden. Met de verhouding tussen referentie-stof en je stof die je wilt
meten bepaal je de concentratie.
,Scheidingsprincipe
- Gelfiltratie
Gelfiltratie wordt gebruikt om eiwitten van verschillende grootte van elkaar te scheiden. Het principe
van gelfiltratie berust erop dat kleine eiwitten een langere weg door een poreuze matrix moeten
afleggen dan de grote eiwitten. Het gevolg is dat kleine eiwitten later van de kolom eluren (=van de
kolom afkomen) dan grote eiwitten. Eiwitten van verschillende grootte hebben dus een verschillende
hoeveelheid eluens (oplosmiddel/buffer) nodig om van de kolom te elueren. De verschillende eluties
worden aan het einde van de kolom in aparte buizen verzameld, zodat eiwitten van verschillende
grootte van elkaar worden gescheiden. De verschillende buizen worden vervolgens geanalyseerd op
de aanwezigheid van eiwitten en verder bewerkt.
Scheiding op basis van het moleculair gewicht; beads gedragen zich als een filter. Eerst gaan de grote
moleculen en daarna de kleinste moleculen. De grote moleculen kunnen de poriën van de bol niet in:
Elutie volume: Ve = V0
(Zeer) kleine moleculen kunnen alle poriën van de bol in:
Ve = V0 + Vi = Vz
Met de ijklijn kan je de molmassa uitrekenen met de gelfiltratie. Delta y : Delta x
, Les 2 Gelfiltratie en affiniteitschromatografie
Eiwitten
- Aminozuren
- Structuren
- Interacties
Aminozuren zijn opgebouwd uit aminogroepen en carboxylgroepen. Er zijn hydrofobe, aploaire,
aminozuren. De zij-groep heeft geen O/OH om water mee te binden. De hydrofiele, polaire,
aminozuren hebben een zij-groep met een O/OH groep.
Aromatische aminozuren zijn aminozuren met een ring, aromatische ringen. De aromatische
aminozuren zijn de hydrofobe Phenylalanine, Tryptophan en de hydrofiele Tyrosine. De
verontreiniging van DNA/RNA is een groot probleem, omdat ze een aromatische ring bevatten.
Naar hydrofobe en hydrofiele aminozuren zijn er ook zure en basische aminozuren. Een aminozuur is
uur als er een COO of COOH groep in zit. De basische aminozuren herkennen we aan de NH groep die
een plusje opneemt. De zuren aminozuren:
- Aspartic acid (Asp of D)
- Glutamic acid (Glu of E)
En de basische aminozuren zijn:
- Lysine (Lys of K)
- Arginine (Arg of R)
- Histidine (His of H)
Aminozuren kunnen aan elkaar gekoppeld worden door een peptide binding. H2O wordt afgesplitst
en er ontstaat een CONH, tussen de twee aminozuren.
Eiwitten kunnen interacties met elkaar gaan, maar wel tijdelijk. Welke krachten gebruiken eiwitten
om interacties met elkaar aan te gaan:
- Waterstofbruggen
- Hydrofobe interacties
- Vd Waals interacties
- Ionbinding
- Zwavelbruggen, ook covalent
- Andere covalente verbinden
De meeste van deze bindingen, behalve covalente verbinden, zijn tijdelijk. Ze kunnen binden en
weer loslaten. Transient = tijdelijk. Door de bindingen krijgen we een tijdelijke verandering in de
structuur activatie.
Primaire structuur = aminozuren. Met amino end en carboxy end.
Secondaire structuur = hydrogen bond. A helix
Tetraire structuur = hydrophobic interactions and van der waals interactions + ionic bond.
Polypeptide backbone.
Quaternaire structuur = a subunit, b subunit. Hemoglobine.
