Chromatografie
Chromatografie wordt gebruikt om de afzonderlijke bestanddelen in een mengsel
te scheiden op basis van verschil in fysieke eigenschappen zoals: moleculaire
grootte, vorm, lading, beweeglijkheid, oplosbaarheid en de adsorptie.
De essentiële componenten van een chromatografisch systeem
zijn:
- Stationaire fase: een vaste stof, gel of een
geïmmobiliseerde vloeistof, vastgehouden door een
dragermatrix.
- Chromatografisch bed: de stationaire fase kan worden
verpakt in een glazen of metalen kolom, uitgespreid als
een dunne laag op een laken van glas of plastic, of
geadsorbeerd op cellulosevezels.
- Mobiele fase: een vloeistof of een gas die dient als
oplosmiddel. De mobiele fase draagt het mengsel door de
stationaire fase en elueert vanuit het chromatografisch
bed.
- Delivery system: om de mobiele door het
chromatografisch bed te passeren.
- Detection system: om de test stoffen te controleren.
De individuele stoffen reageren in verschillende mate met de stationaire fase van
de kolom terwijl ze door het systeem worden gevoerd, hierdoor wordt er
scheiding bereikt. In een chromatografisch systeem zullen de stoffen die een
sterke affiniteit met de kolom hebben het meest worden vertraagd. De stoffen
die weinig affiniteit hebben met de kolom, zullen een minimale vertraging
ondergaan. Hierdoor is er verschil in de afgelegde afstand of in de elutietijd.
Er moeten meestal compromissen worden gemaakt bij de chromatografie. Het
proces is meestal een compromis van drie dingen: de scheiding, de tijdsduur en
het volume van het eluens. Dus als je een groot sample volume hebt en je wil
een goede scheiding van het mengsel bereiken, dan zal de chromatografie veel
tijd kosten.
Zwart bestaat uit meerdere kleuren. Hierbij heeft de rode kleur een lage affiniteit,
deze komt snel van de kolom af. De groene kleur heeft een hogere affiniteit en
komt vertraagd van de kolom af.
Binnen de chromatografie zijn 2 dingen te
onderscheiden: preparatief vs analytisch.
Het doel van de preparatieven chromatografie
is het voorbereiden om zuivere stoffen te
krijgen. Bij de analytische chromatografie wil
je onderzoeken wat er in het mengsel
aanwezig is.
,Typen chromatografie
Chromatografische systemen kunnen worden
onderverdeeld in verschillende categorieën volgens de
vorm van het chromatografisch bed, de aard van de
mobiele en stationaire fase en de methode van
scheiding.
Thin-layer chromatografie (TLC) en papier
chromatografie
Bij dunne laag chromatografie wordt het sample op
een enkel punt aangebracht door middel van een
microcapillair. Het papier wordt volledig gedroogd en
wordt vervolgens in een glazen bakje gezet met daarin een klein laagje
oplosmiddel. Het papier wordt verwijderd als het oplosmiddel over 80-90% van
het papier is gelopen.
Stationaire fase: Dunne laag absorberend materiaal zoals bijvoorbeeld een silica
gel. Deze is vaak polair.
Mobiele fase: Beweegt over de stationaire fase door de capillaire werking. Deze is
vaak apolair.
Detectie: De detectie gaat d.m.v. aankleuren / UV-licht / radioactief.
De beweging van een individuele substantie kan worden uitgedrukt in de
relatieve frontale mobiliteit, de Rf-waarde. De Rf-waarde is de loopafstand, deze
kan worden bepaald als er geen referentiestof aanwezig is. Ook kan de beweging
worden uitgedrukt tegenover een referentiestof, dit is de Rx-waarde.
De waarde is een constante voor een bepaalde stof en oplosmiddel systeem
(onder standaard omstandigheden) en het weerspiegelt nauw de verdeling van
de stof tussen de stationaire en de mobiele fase. Rx en Rf zijn afhankelijk van de
mobiele en de stationaire fase die gebruikt wordt. Deze zijn op te zoeken in de
tabellen van het BINAS. Het principe is gebaseerd op absorptie.
Er worden een aantal referenties aangebracht, zodat deze kunnen worden
vergeleken met de te onderzoeken stoffen. Stof C zit lager op de plaat, deze is
dus meer polair dan stof A. Hoe polairder de stof, hoe lager de stof zal uitkomen.
,Polariteit
Elektronen in covalente bindingen zijn niet ‘eerlijk verdeeld’. Dit zorgt voor een
diploolmoment. Het dipoolmoment is afhankelijk van de molecuulstructuur.
Chloor zelf is apolair. Als er waterstoffen aan worden toegevoegd, vindt er een
dipoolmoment plaats en wordt de stof polair. Als alles eromheen weer is
vervangen door een waterstof wordt de stof weer apolair.
, Kolom chromatografie:
Bij de kolom chromatografie wordt er gebruik gemaakt van een
glazen kolom met de juiste stationaire fase en de mobiele fase wordt
in evenwicht gebracht door deze door de kolom te leiden door
middel van zwaartekracht of met behulp van een peristaltische
pomp met een lage druk. Vervolgens kan het sample worden
aangebracht in de top van de kolom om een discrete band te
vormen van het materiaal. Dit wordt vervolgens door de kolom heen
gebracht door de mobiele fase. Als de individuele stoffen een
verschil in migratie hebben, worden ze al gescheiden in de kolom en
elueren op verschillende tijden doordat de mobiele fase door de
kolom verplaatst.
De stoffen die ge-elueerd zijn kunnen worden gedetecteerd door de
mobiele fase op te vangen in epjes wanneer het van de kolom af
elueerd. Fracties die 2-5% van het bed volume bevatten worden
meestal verzameld en geanalyseerd door middel van een chemische
test.
Vervolgens kan er een chromatogram worden gemaakt door de
hoeveelheid stof uit te zetten tegenover de tijd, elutievolume of fractienummer.
Hierdoor komt er voor elke stof een piek die zichtbaar wordt.
Voorbeeld chromatogram bij scheiding stof a en b.
Een probleem bij alle kolomchromatografische scheidingen is diffusie, waardoor
de banden breder worden en dus de scheiding (R) minder wordt. Bij een hogere
elutiesnelheid is er minder diffusie, dus betere scheiding. Dus hoe sneller de
mobiele fase over de kolom gaat (door de elutiesnelheid te verhogen), hoe
betere scheiding van de stoffen (hoe minder de diffusie). Daarom worden vaak
hoge-druk pompen gebruikt, wat speciale eisen stelt aan het dragermateriaal.
Het dragermateriaal is HPLC (high-performance liquid chromatography) of FPLC
(fast protein liquid cromatography).
Chromatografie wordt gebruikt om de afzonderlijke bestanddelen in een mengsel
te scheiden op basis van verschil in fysieke eigenschappen zoals: moleculaire
grootte, vorm, lading, beweeglijkheid, oplosbaarheid en de adsorptie.
De essentiële componenten van een chromatografisch systeem
zijn:
- Stationaire fase: een vaste stof, gel of een
geïmmobiliseerde vloeistof, vastgehouden door een
dragermatrix.
- Chromatografisch bed: de stationaire fase kan worden
verpakt in een glazen of metalen kolom, uitgespreid als
een dunne laag op een laken van glas of plastic, of
geadsorbeerd op cellulosevezels.
- Mobiele fase: een vloeistof of een gas die dient als
oplosmiddel. De mobiele fase draagt het mengsel door de
stationaire fase en elueert vanuit het chromatografisch
bed.
- Delivery system: om de mobiele door het
chromatografisch bed te passeren.
- Detection system: om de test stoffen te controleren.
De individuele stoffen reageren in verschillende mate met de stationaire fase van
de kolom terwijl ze door het systeem worden gevoerd, hierdoor wordt er
scheiding bereikt. In een chromatografisch systeem zullen de stoffen die een
sterke affiniteit met de kolom hebben het meest worden vertraagd. De stoffen
die weinig affiniteit hebben met de kolom, zullen een minimale vertraging
ondergaan. Hierdoor is er verschil in de afgelegde afstand of in de elutietijd.
Er moeten meestal compromissen worden gemaakt bij de chromatografie. Het
proces is meestal een compromis van drie dingen: de scheiding, de tijdsduur en
het volume van het eluens. Dus als je een groot sample volume hebt en je wil
een goede scheiding van het mengsel bereiken, dan zal de chromatografie veel
tijd kosten.
Zwart bestaat uit meerdere kleuren. Hierbij heeft de rode kleur een lage affiniteit,
deze komt snel van de kolom af. De groene kleur heeft een hogere affiniteit en
komt vertraagd van de kolom af.
Binnen de chromatografie zijn 2 dingen te
onderscheiden: preparatief vs analytisch.
Het doel van de preparatieven chromatografie
is het voorbereiden om zuivere stoffen te
krijgen. Bij de analytische chromatografie wil
je onderzoeken wat er in het mengsel
aanwezig is.
,Typen chromatografie
Chromatografische systemen kunnen worden
onderverdeeld in verschillende categorieën volgens de
vorm van het chromatografisch bed, de aard van de
mobiele en stationaire fase en de methode van
scheiding.
Thin-layer chromatografie (TLC) en papier
chromatografie
Bij dunne laag chromatografie wordt het sample op
een enkel punt aangebracht door middel van een
microcapillair. Het papier wordt volledig gedroogd en
wordt vervolgens in een glazen bakje gezet met daarin een klein laagje
oplosmiddel. Het papier wordt verwijderd als het oplosmiddel over 80-90% van
het papier is gelopen.
Stationaire fase: Dunne laag absorberend materiaal zoals bijvoorbeeld een silica
gel. Deze is vaak polair.
Mobiele fase: Beweegt over de stationaire fase door de capillaire werking. Deze is
vaak apolair.
Detectie: De detectie gaat d.m.v. aankleuren / UV-licht / radioactief.
De beweging van een individuele substantie kan worden uitgedrukt in de
relatieve frontale mobiliteit, de Rf-waarde. De Rf-waarde is de loopafstand, deze
kan worden bepaald als er geen referentiestof aanwezig is. Ook kan de beweging
worden uitgedrukt tegenover een referentiestof, dit is de Rx-waarde.
De waarde is een constante voor een bepaalde stof en oplosmiddel systeem
(onder standaard omstandigheden) en het weerspiegelt nauw de verdeling van
de stof tussen de stationaire en de mobiele fase. Rx en Rf zijn afhankelijk van de
mobiele en de stationaire fase die gebruikt wordt. Deze zijn op te zoeken in de
tabellen van het BINAS. Het principe is gebaseerd op absorptie.
Er worden een aantal referenties aangebracht, zodat deze kunnen worden
vergeleken met de te onderzoeken stoffen. Stof C zit lager op de plaat, deze is
dus meer polair dan stof A. Hoe polairder de stof, hoe lager de stof zal uitkomen.
,Polariteit
Elektronen in covalente bindingen zijn niet ‘eerlijk verdeeld’. Dit zorgt voor een
diploolmoment. Het dipoolmoment is afhankelijk van de molecuulstructuur.
Chloor zelf is apolair. Als er waterstoffen aan worden toegevoegd, vindt er een
dipoolmoment plaats en wordt de stof polair. Als alles eromheen weer is
vervangen door een waterstof wordt de stof weer apolair.
, Kolom chromatografie:
Bij de kolom chromatografie wordt er gebruik gemaakt van een
glazen kolom met de juiste stationaire fase en de mobiele fase wordt
in evenwicht gebracht door deze door de kolom te leiden door
middel van zwaartekracht of met behulp van een peristaltische
pomp met een lage druk. Vervolgens kan het sample worden
aangebracht in de top van de kolom om een discrete band te
vormen van het materiaal. Dit wordt vervolgens door de kolom heen
gebracht door de mobiele fase. Als de individuele stoffen een
verschil in migratie hebben, worden ze al gescheiden in de kolom en
elueren op verschillende tijden doordat de mobiele fase door de
kolom verplaatst.
De stoffen die ge-elueerd zijn kunnen worden gedetecteerd door de
mobiele fase op te vangen in epjes wanneer het van de kolom af
elueerd. Fracties die 2-5% van het bed volume bevatten worden
meestal verzameld en geanalyseerd door middel van een chemische
test.
Vervolgens kan er een chromatogram worden gemaakt door de
hoeveelheid stof uit te zetten tegenover de tijd, elutievolume of fractienummer.
Hierdoor komt er voor elke stof een piek die zichtbaar wordt.
Voorbeeld chromatogram bij scheiding stof a en b.
Een probleem bij alle kolomchromatografische scheidingen is diffusie, waardoor
de banden breder worden en dus de scheiding (R) minder wordt. Bij een hogere
elutiesnelheid is er minder diffusie, dus betere scheiding. Dus hoe sneller de
mobiele fase over de kolom gaat (door de elutiesnelheid te verhogen), hoe
betere scheiding van de stoffen (hoe minder de diffusie). Daarom worden vaak
hoge-druk pompen gebruikt, wat speciale eisen stelt aan het dragermateriaal.
Het dragermateriaal is HPLC (high-performance liquid chromatography) of FPLC
(fast protein liquid cromatography).
