Samenvatting voor het theoretisch examen van het vak: Geïntegreerd practicum: moleculaire biologie en genetica (16/20)

Geïntegreerd practicum: moleculaire biologie en genetica
1. Principe segregatie analyse + toepassen
Segregatieanalyse wordt gebruikt om te bepalen of familiegegevens voor bepaalde
aandoeningen of andere kenmerken compatibel zijn met specifieke manieren van
overerving. De overervingsttestende modellen in de segregatieanalyses zijn monogene
(Mendeliaanse), digene of polygene modellen.
 Oefeningen hoogswaarschijnlijk niet gevraagd op examen, vooral handig voor later

2. Analyseren van resultaten TPA 25 en VNTR D1S80
ALU TPA25 analyse
 Dat zit in een tissue plasminogen activator gen
 ALU repititief DNA element van 300 bp dat je hebt of niet hebt
 Aantonen met PCR:
o Afwezig: band bij 100 bp
o Aanwezig: band bij 400 bp
 +/+: homozygoot aanwezig
 +/-: heterozygoot aanwezig
 -/-: homozygoot afwezig

VNTR (D1S80)
 Variable Number of Tandem Repeats
o D1S80: tandem repeat van 16 bp die je verschillende keren kan hebben
o Aantal repeats zijn polymorf
 Lengte PCR fragment bepaalt door aantal repeats
o Primer en flankerende sequentie = 2x20 bp + 148 bp
o Lengte D1S80 = lengte van repeat (16 bp) * aantal repeats
o Berekening aantal repeats (n):
 N= (lengte PCR product -148 bp)/16 bp

3. Principe HRM en analyseren van resultaten
Principe
 High resolution melting (HRM) analyse
 Detecteren van:
o Polymorfismen of mutaties in dsDNA via DNA smeltcurve analyse
o Smelttemperatuur (Tm):
 T waarbij complementaire DNA strengen voor de helft gescheiden zijn
 T is afhankelijk van de DNA sequentie
o Verschillen in DNA sequentie zijn aantoonbaar door de verschillen in
smelttemperatuur  verandering in smeltcurve
o NIET mogelijk om SNP-genotype te bepalen, wel zeggen of een SNP aanwezig
is of niet
 Smelttemperatuur (Tm):
o T waarbij complementaire DNA strengen voor de helft gescheiden zijn
o T is afhankelijk van de DNA sequentie
o Verschillen in DNA sequentie zijn aantoonbaar door de verschillen in
smelttemperatuur  verandering in smeltcurve
 PCR targetsequentie is fragment rond SNP of mutatie

,  Monitoring van proces in real-time via:
o SYBR-green
o Taqman probes
SYBR-green:
 Fluorescentie molecule
 Bindt aan kleine groeve van dsDNA
 Fluorescentie:
o Niet fluorescent als DNA enkelstrengig is  denaturatie en annealing fase
o Fluorescent wanneer gebonden aan dsDNA  elongatie fase
 SYBR-green bindt enkel aan dsDNA, dus als dsDNA in PCR reactie overgaat naar
ssDNA verlaagt de fluorescentie (SYBR-green wordt losgemaakt van de strand)

Taqman probes:
 Primer en probe nodig
 Primer bindt op fragment
 Probe:
o Bindt ook op fragment
o Complementair aan de target regio van DNA
o Bevat 2 labels:
 Fluorescent reporter label aan 5’uiteinde  wanneer geëxciteerd
door laser, zendt het fluorescent licht uit
 Quencher of dover label aan 3’ uiteinde
 Fluorescentie:
o Niet fluorescent in denaturatie en annealingsfase
 Beide labels bevinden zich dicht bij elkaar
 Quencher interfereert met fluorescentie van de reporter
o Fluorescent in extensie fase  afknippen van fluorofoor en quencher tgv
probe displacement
 Wanneer Taq polymerase DNA amplificeert  verwijdering van het
reporterlabel (Taq polymerase: 5’-3’ nucleaseactiviteit)  reporter
wordt niet meer geïnterfereerd door de quencher fluorescentie kan
uitgezonden en gedetecteerd worden
o Meer dsDNA, meer fluorescentie

Volgorde:
 Gewone PCR met gewone primers om target DNA te amplificeren
 dsDNA denatureren met snelle renaturatie (mismatchen voorkomen)
 graduele denaturatie (systematisch stijgen van T)  dsDNA valt uiteen 
fluorescentie meten  bepalen wanneer DNA uit elkaar gevallen is (dit hangt van
genotype af)