College 1 & 2 – Hoofdstuk 7, Hoofdstuk 10.1, 10.2, 10.4
Experiment van Frederick Griffith 1928 bacterie Streptococcus pneumoniae
Bacterie veroorzaakt longontsteking bij mensen, muizen gaan dood
Er werden twee stammen gebruikt; S strain live cells ingesloten in
polysacharidecapsule, & een stam waar de polysacharidecapsule afwezig is
R strain
Door de S strain te koken, gingen de cellen dood zorgde niet voor dood
van de muis
Muizen met dode S strain gemengd met R strain gaan wel dood dode S-cellen
en R-cellen vormden samen levende S-cellen transformatie
Om te bepalen hoe deze transformatie veroorzaakt werd, is er een
nieuw experiment gedaan belangrijke categorieën chemicaliën
van dode cellen vernietigen
Mengsel verloor alleen transformerende vermogen wanneer
DNase DNA opbreekt dit verklaart dat DNA genetisch
materiaal is
Veel wetenschappers in die tijd geloofden niet dat DNA genetisch materiaal
was
Aanvullend bewijs door experiment
Phage T2 virus dat bacteriën infecteert
Welk materiaal injecteert het virus?
Eiwit en DNA kregen verschillende labels
Gelabelde eiwit bleef in de phage (ghosts)
Gelabeld DNA kwam terecht in de bacterie
DNA moet informatie op kunnen slaan, kunnen repliceren en kunnen muteren
Hieraan voldeed de dubbele helixstructuur
Bij DNA replicatie zijn nieuw toegevoegde nucleotiden afkomstig uit
een pool vrije nucleotiden in de cel aanwezig
Semiconservative replication nieuwe streng komt vast aan oude streng
Conservative replication oude blijft intact at the end en er komen nieuwe strengen
Dispersive replication dochtermoleculen bestaan uit segmenten van oud en nieuw DNA
Om erachter te komen welke vorm van replicatie bij DNA speelt, werd
experiment uitgevoerd met behulp van dichtheid (tussen oude en nieuwe
streng)
Tautomerisatie tautomeer (isomeer van base (imino- of enolvorm ipv
keto)) wordt ingebouwd
Replisome coördineert activiteiten op de replicatievork
De katalytische kern van DNA polymerase III maakt deel uit van
polymerase III holoenzym bestaande uit 2 kernen en veel
hulpeiwitten
,Één kern zorgt voor de synthese van de leading strand, en de ander voor de lagging strand
De β clamp houdt DNA aan de polymerase III vast
Primase maakt RNA primer
Helicase verstoort waterstofbruggen tussen 2 strengen
SSB-eiwitten voorkomen herbinding van 2 strengen in helix
Supercoils ontstaan in circulair DNA extra draaiing
Denk aan telefoondraad
Kunnen verwijderd worden door topoisomerasen
Topoisomerasen breken streng(en) waardoor DNA kan (terug)draaien en voegt de strengen daarna
weer samen
Het samenstellen van het replisome is een ordelijk proces
Eerst bindt een eiwit DnaA aan DnaA-box
De oorsprong wordt afgewikkeld bij veel AT baseparen
Na het afwikkelen, binden extra DnaA-eiwitten aan enkelstrengige gebieden
Helicases binden en schuiven in 5’ naar 3’ richting om de replicatievork te openen
Primase en DNA polymerase III binden nu ook aan het enkelstrengs DNA
DnaA is alleen voor de assemblage van het replisome, maar doet niets bij repliceren
Deze prokaryote replisome lijkt heel erg op een eukaryote
replisome (is iets complexer)
In eukaryote chromosomen zitten meer replication origins om sneller
te repliceren
ORC origin recognition complex (voor eukaryoten) hier binden
helicase, Cdc6 en Cdt1 aan. Cdc6 en Cdt1 worden
afgebroken
ORC’s worden gedacht te interacten met de oorsprong door
andere eiwitcomplexen, en niet met een specifieke sequentie
Euchromatine repliceert vroeg in S-fase
Heterochromatine repliceert laat in S-fase
Dus eerst binden ORC’s aan genrijke gebieden en daarna
aan genarme gebieden
Het repliceren van telomeren is moeilijk. Op lagging strand wordt laatste primer soms
verwijderd, waardoor deel telomeer niet gerepliceerd kan worden
Hierdoor krijg je 3’ overhang van complementaire leading strand
Hiervoor bestaan dus telomeren niet-coderende sequentie aan chromosoompunt
Korte tandemherhalingen waarbij volgorde niet altijd hetzelfde is
Telomerase voegt deze herhalingen toe aan de 3’ chromosoom uiteinden
Telomerase draagt een klein RNA-molecuul dat fungeert als sjabloon voor de herhalingen
Telomerase-RNA bindt aan 3’ DNA-overhang en voegt enkele nucleotiden toe
Primase en DNA-polymerase gebruiken het verlengde 3’ uiteinde weer als sjabloon om de
andere streng te verlengen
Het polymerase van telomerase heeft een reverse transcriptase activiteit (van RNA naar DNA)
Er komen ook beschermende doppen op de chromosoomuiteindes die de 3’ overhang afzonderen
Zonder de kap wordt het als kapot en zal het ook zo behandeld worden
Dubbelstrengige breuken kunnen leiden tot chromosomale instabiliteit kanker
Bij somatische cellen is er weinig tot geen telomerase activiteit bij elke celdeling worden
telomeren korter cel senescentie gaat op een gegeven moment in
, Verkorting telomeren staat in verband met veroudering
Mensen met het Werner-syndroom hebben een mutatie in een gen (WRN) codeert voor helicase
dat associeert met eiwitten in de telomeerkap verstoort telomeer sneller verouderen
Kankercellen hebben wel veel telomerase-activiteit geen senescentie altijd blijven leven/delen
Om een gen te isoleren, wordt er een DNA monster genomen die het gen bevat donor-DNA
Meestal bevat dit het hele genoom
- Donor-DNA wordt ingebracht in plasmide of bacterieel virus dat het gen draagt en
amplificeert vector
- DNA-moleculen worden in stukken geknipt door restrictie-
endonucleasen
- Elk fragment wordt ingebracht in vectorchromosoom om
recombinante DNA-moleculen te vormen
- Recombinante DNA-moleculen worden overgebracht in bacteriële
cellen
- Binnen cel wordt het recombinante molecuul met vector
geamplificeerd tijdens celdeling
Dit wordt DNA cloning genoemd, gebeurt in vivo
De in vitro manier wordt PCR (polymerase chain reaction) genoemd
PCR vindt het doel-DNA door complementaire binding aan specifieke
korte DNA-moleculen (primers)
Primers sturen replicatieproces door DNA-polymerase
(exponentieel cyclisch)
DNA technologie hangt af van twee basisprincipes:
- Vermogen van eiwitten om specifieke sequenties te herkennen en eraan te binden
- Vermogen van complementair enkelstrengs DNA/RNA om dubbelstrengs te vormen
De endonucleasen knippen in specifieke DNA-sequenties
restrictieplaatsen
Restrictie-enzymen creëren vaak “sticky ends”
EcoRI zet circulair DNA om in lineair molecuul met “sticky
ends”
DNA-palindrome beide strengen dezelfde sequentie, maar in
antiparallelle oriëntatie
Verschillende restrictie-enzymen knippen in palindrome sequenties
verspringende posities
De uiteindes worden “sticky” genoemd omdat ze enkelstrengs zijn maar
toch een aan een complementaire sequentie kunnen binden
Hybridisatie combineren van complementaire strengen zodat ze een paar
vormen
DNA-fragmenten uit PCR hebben stompe uiteindes
Stompe uiteindes komen ook door restrictie-enzymen
Kunnen niet aan elkaar plakken (niet sticky)
Om wel sticky ends te krijgen uit PCR, zijn er speciale PCR-primers met restrictie-
endonuclease-herkenningssequenties na restrictie-enzym klaar om als vector te
worden ingevoegd
Een andere manier om sticky ends te krijgen linkers/adapters toevoegen aan cDNA
en ligase daarna restrictie-enzym voor het vormen van de sticky ends
Experiment van Frederick Griffith 1928 bacterie Streptococcus pneumoniae
Bacterie veroorzaakt longontsteking bij mensen, muizen gaan dood
Er werden twee stammen gebruikt; S strain live cells ingesloten in
polysacharidecapsule, & een stam waar de polysacharidecapsule afwezig is
R strain
Door de S strain te koken, gingen de cellen dood zorgde niet voor dood
van de muis
Muizen met dode S strain gemengd met R strain gaan wel dood dode S-cellen
en R-cellen vormden samen levende S-cellen transformatie
Om te bepalen hoe deze transformatie veroorzaakt werd, is er een
nieuw experiment gedaan belangrijke categorieën chemicaliën
van dode cellen vernietigen
Mengsel verloor alleen transformerende vermogen wanneer
DNase DNA opbreekt dit verklaart dat DNA genetisch
materiaal is
Veel wetenschappers in die tijd geloofden niet dat DNA genetisch materiaal
was
Aanvullend bewijs door experiment
Phage T2 virus dat bacteriën infecteert
Welk materiaal injecteert het virus?
Eiwit en DNA kregen verschillende labels
Gelabelde eiwit bleef in de phage (ghosts)
Gelabeld DNA kwam terecht in de bacterie
DNA moet informatie op kunnen slaan, kunnen repliceren en kunnen muteren
Hieraan voldeed de dubbele helixstructuur
Bij DNA replicatie zijn nieuw toegevoegde nucleotiden afkomstig uit
een pool vrije nucleotiden in de cel aanwezig
Semiconservative replication nieuwe streng komt vast aan oude streng
Conservative replication oude blijft intact at the end en er komen nieuwe strengen
Dispersive replication dochtermoleculen bestaan uit segmenten van oud en nieuw DNA
Om erachter te komen welke vorm van replicatie bij DNA speelt, werd
experiment uitgevoerd met behulp van dichtheid (tussen oude en nieuwe
streng)
Tautomerisatie tautomeer (isomeer van base (imino- of enolvorm ipv
keto)) wordt ingebouwd
Replisome coördineert activiteiten op de replicatievork
De katalytische kern van DNA polymerase III maakt deel uit van
polymerase III holoenzym bestaande uit 2 kernen en veel
hulpeiwitten
,Één kern zorgt voor de synthese van de leading strand, en de ander voor de lagging strand
De β clamp houdt DNA aan de polymerase III vast
Primase maakt RNA primer
Helicase verstoort waterstofbruggen tussen 2 strengen
SSB-eiwitten voorkomen herbinding van 2 strengen in helix
Supercoils ontstaan in circulair DNA extra draaiing
Denk aan telefoondraad
Kunnen verwijderd worden door topoisomerasen
Topoisomerasen breken streng(en) waardoor DNA kan (terug)draaien en voegt de strengen daarna
weer samen
Het samenstellen van het replisome is een ordelijk proces
Eerst bindt een eiwit DnaA aan DnaA-box
De oorsprong wordt afgewikkeld bij veel AT baseparen
Na het afwikkelen, binden extra DnaA-eiwitten aan enkelstrengige gebieden
Helicases binden en schuiven in 5’ naar 3’ richting om de replicatievork te openen
Primase en DNA polymerase III binden nu ook aan het enkelstrengs DNA
DnaA is alleen voor de assemblage van het replisome, maar doet niets bij repliceren
Deze prokaryote replisome lijkt heel erg op een eukaryote
replisome (is iets complexer)
In eukaryote chromosomen zitten meer replication origins om sneller
te repliceren
ORC origin recognition complex (voor eukaryoten) hier binden
helicase, Cdc6 en Cdt1 aan. Cdc6 en Cdt1 worden
afgebroken
ORC’s worden gedacht te interacten met de oorsprong door
andere eiwitcomplexen, en niet met een specifieke sequentie
Euchromatine repliceert vroeg in S-fase
Heterochromatine repliceert laat in S-fase
Dus eerst binden ORC’s aan genrijke gebieden en daarna
aan genarme gebieden
Het repliceren van telomeren is moeilijk. Op lagging strand wordt laatste primer soms
verwijderd, waardoor deel telomeer niet gerepliceerd kan worden
Hierdoor krijg je 3’ overhang van complementaire leading strand
Hiervoor bestaan dus telomeren niet-coderende sequentie aan chromosoompunt
Korte tandemherhalingen waarbij volgorde niet altijd hetzelfde is
Telomerase voegt deze herhalingen toe aan de 3’ chromosoom uiteinden
Telomerase draagt een klein RNA-molecuul dat fungeert als sjabloon voor de herhalingen
Telomerase-RNA bindt aan 3’ DNA-overhang en voegt enkele nucleotiden toe
Primase en DNA-polymerase gebruiken het verlengde 3’ uiteinde weer als sjabloon om de
andere streng te verlengen
Het polymerase van telomerase heeft een reverse transcriptase activiteit (van RNA naar DNA)
Er komen ook beschermende doppen op de chromosoomuiteindes die de 3’ overhang afzonderen
Zonder de kap wordt het als kapot en zal het ook zo behandeld worden
Dubbelstrengige breuken kunnen leiden tot chromosomale instabiliteit kanker
Bij somatische cellen is er weinig tot geen telomerase activiteit bij elke celdeling worden
telomeren korter cel senescentie gaat op een gegeven moment in
, Verkorting telomeren staat in verband met veroudering
Mensen met het Werner-syndroom hebben een mutatie in een gen (WRN) codeert voor helicase
dat associeert met eiwitten in de telomeerkap verstoort telomeer sneller verouderen
Kankercellen hebben wel veel telomerase-activiteit geen senescentie altijd blijven leven/delen
Om een gen te isoleren, wordt er een DNA monster genomen die het gen bevat donor-DNA
Meestal bevat dit het hele genoom
- Donor-DNA wordt ingebracht in plasmide of bacterieel virus dat het gen draagt en
amplificeert vector
- DNA-moleculen worden in stukken geknipt door restrictie-
endonucleasen
- Elk fragment wordt ingebracht in vectorchromosoom om
recombinante DNA-moleculen te vormen
- Recombinante DNA-moleculen worden overgebracht in bacteriële
cellen
- Binnen cel wordt het recombinante molecuul met vector
geamplificeerd tijdens celdeling
Dit wordt DNA cloning genoemd, gebeurt in vivo
De in vitro manier wordt PCR (polymerase chain reaction) genoemd
PCR vindt het doel-DNA door complementaire binding aan specifieke
korte DNA-moleculen (primers)
Primers sturen replicatieproces door DNA-polymerase
(exponentieel cyclisch)
DNA technologie hangt af van twee basisprincipes:
- Vermogen van eiwitten om specifieke sequenties te herkennen en eraan te binden
- Vermogen van complementair enkelstrengs DNA/RNA om dubbelstrengs te vormen
De endonucleasen knippen in specifieke DNA-sequenties
restrictieplaatsen
Restrictie-enzymen creëren vaak “sticky ends”
EcoRI zet circulair DNA om in lineair molecuul met “sticky
ends”
DNA-palindrome beide strengen dezelfde sequentie, maar in
antiparallelle oriëntatie
Verschillende restrictie-enzymen knippen in palindrome sequenties
verspringende posities
De uiteindes worden “sticky” genoemd omdat ze enkelstrengs zijn maar
toch een aan een complementaire sequentie kunnen binden
Hybridisatie combineren van complementaire strengen zodat ze een paar
vormen
DNA-fragmenten uit PCR hebben stompe uiteindes
Stompe uiteindes komen ook door restrictie-enzymen
Kunnen niet aan elkaar plakken (niet sticky)
Om wel sticky ends te krijgen uit PCR, zijn er speciale PCR-primers met restrictie-
endonuclease-herkenningssequenties na restrictie-enzym klaar om als vector te
worden ingevoegd
Een andere manier om sticky ends te krijgen linkers/adapters toevoegen aan cDNA
en ligase daarna restrictie-enzym voor het vormen van de sticky ends
