Mol mic
Les 1 & 2
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur van nucleinezuren
- Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen
- Herkent sense en anti-sense sequenties
- Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten voldoen
- Weet welke factoren van belang zijn bij het ontwerpen van primers/probes
- Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
- Begrijpt het principe van real time PCR
- Kent de relatie tussen het aantal cycli en de hoeveelheid DNA-amplimeren
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Kan een keuze maken voor een geschikt target voor een specifieke diagnostische real
time PCR
- Kan een DNA alignment analyseren en interpreteren voor het ontwerpen van primers
(m.b.v.bijv.Primer3)
- Kan het onderscheid benoemen voor moleculaire detectie van verschillende micro-
organismen (virussen, bacteriën)
- Kent de diverse typen controles en het gebruik er van (positieve, negatieve, interne
controles en endo-/exogenecontrole)
- Kan de detectiegrens, specificiteit en sensitiviteit berekenen
- Kan de data van een real time PCR reactie met gebruik van SYBR green en Taqman
probes te interpreteren
- Kan de uitkomst van een kwantitatieve PCR omrekenen naar de load van een
monster
Morfologie: hoe ziet bacterie onder microscoop uit
DNA
16s RNA
- Zit alleen in bacteriën
- Wordt gebruikt om bacteriën met elkaar te vergelijken (familie, geslacht ect.)
Gen
o Geconserveerde regio; bij elke soort zelfde, anders sterft soort uit
o Variabele regio; anders bij elke soort, kan soort aan herkent worden
Structuur DNA
o Dubbele helix met suikermolecuul, fosfaat groep en een
basen
o Waterstofbruggen verbinden baseparen
o Strengen tegenovergesteld & anti-parallel
,Basen
o Purine (A, G) bindt aan pyrimidine (T, C)
o Adenine bindt aan thymine met 2 waterstofbruggen
o Guanine bindt aan cytosine met 3 waterstofbruggen
RNA
- Uracil i.p.v. thymine
- Enkelstrengs
- Ribose i.p.v. deoxyribeose
- Reverse trasriptase; cDNA
PCR
Taq-DNA polymerase; snelle maar slordige polymerase, geen proofreading
- Handig bij herkenning virus
- Niet handig bij sequensing
Polymerase; twee strengen nodig om te binden
Primers
- 18-25 nucleotiden lang
- Hoog G-C gehalte (40-70%)
- Ongv. zelfde annealing temperatuur
- Geen baseparing tussen primer zelf of tussen twee primers (
- (mag niet omklappen, of forward & reverse binden
- Aplicon 75-200 bp. Hoogste efficiëntie
- Smelttemperatuur tussen 50 & 65 graden
Smelttemperatuur (Tm)
o Waar helft van DNA enkelstrengs is en andere helft dubbelstrengs
o Annealing temperatuur; iets onder Tm
Keuze gen & alignment
Primer
- Mag niet 100% gebonden zijn
- Mag losse 5’ kant hebben
- MAG NIET losse 3’ kant hebben
, Real time PCR
Lab vereisten
- Voor PCR detectie specifieke sequenties
- Specifieke technische handelingen, regenta & personeel
- Minimaal 3 verschillende ruimtes
Ruimte 1; maken master mixen, boven druk
Ruimte 2; ‘vieze lab’,toevoeging DNA aan mix ect.
Ruimte 3; PCR lab
‘Ruimte 4’; Aflees ruimte/ elektroforese
Voordelen
- Snelle werking; cycling times </=1,5 uur
- Hoge sample throughput (ongv. 200 monsters/dag)
- Heel gevoelig, in theorie; 1 dubbel strand DNA nodig om aan te tonen
- Detecteert kleinere verschillen tussen samples
- Grote dynamische range (10-10^10 copies)
- Reproduceerbaar
- Laag contaminatie risico
- Flexibele proefopzet
- Multiplex mogelijk (niet goed)
Meerdere targets 1 PCR
Nadelen
- Niet ideaal multiplexing
- Setup; vereiste technische vaardigheden & kennis
- Investering apparatuur
- Intra- & interassay variatie
- RNA instabiel
- DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
Theorie PCR
- Product = 2^n cycli
- Amplificatie; exponentieel, toename; gelimiteerd
- Real-time PCR geeft mogelijkheid om exponentiële fase te zien
> Met Ct kan je hoeveelheid start materiaal berekenen
Ct-waarde
o Cyclusnummer waar signaal boven
vastgestelde drempelwaarde komt
Drie methoden om test te kwantificeren
- DNA-bindende stoffen (SYBR-green,
EvaGreen, LC Green)
- Hydrolyserende probes (TaqMan,
Beacons)
Les 1 & 2
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Heeft kennis en begrip van synthese, en structuur van nucleinezuren
- Kan de verschillende componenten van een PCR mix benoemen
- Herkent sense en anti-sense sequenties
- Kent de voorwaarden waar een primer/probe aan moeten voldoen
- Weet welke factoren van belang zijn bij het ontwerpen van primers/probes
- Begrijpt het principe van DNA bindende stoffen
- Begrijpt het principe van real time PCR
- Kent de relatie tussen het aantal cycli en de hoeveelheid DNA-amplimeren
AMPLIFICATIE TECHNIEKEN VOOR DETECTIE VAN MICRO-ORGANISMEN
- Kan een keuze maken voor een geschikt target voor een specifieke diagnostische real
time PCR
- Kan een DNA alignment analyseren en interpreteren voor het ontwerpen van primers
(m.b.v.bijv.Primer3)
- Kan het onderscheid benoemen voor moleculaire detectie van verschillende micro-
organismen (virussen, bacteriën)
- Kent de diverse typen controles en het gebruik er van (positieve, negatieve, interne
controles en endo-/exogenecontrole)
- Kan de detectiegrens, specificiteit en sensitiviteit berekenen
- Kan de data van een real time PCR reactie met gebruik van SYBR green en Taqman
probes te interpreteren
- Kan de uitkomst van een kwantitatieve PCR omrekenen naar de load van een
monster
Morfologie: hoe ziet bacterie onder microscoop uit
DNA
16s RNA
- Zit alleen in bacteriën
- Wordt gebruikt om bacteriën met elkaar te vergelijken (familie, geslacht ect.)
Gen
o Geconserveerde regio; bij elke soort zelfde, anders sterft soort uit
o Variabele regio; anders bij elke soort, kan soort aan herkent worden
Structuur DNA
o Dubbele helix met suikermolecuul, fosfaat groep en een
basen
o Waterstofbruggen verbinden baseparen
o Strengen tegenovergesteld & anti-parallel
,Basen
o Purine (A, G) bindt aan pyrimidine (T, C)
o Adenine bindt aan thymine met 2 waterstofbruggen
o Guanine bindt aan cytosine met 3 waterstofbruggen
RNA
- Uracil i.p.v. thymine
- Enkelstrengs
- Ribose i.p.v. deoxyribeose
- Reverse trasriptase; cDNA
PCR
Taq-DNA polymerase; snelle maar slordige polymerase, geen proofreading
- Handig bij herkenning virus
- Niet handig bij sequensing
Polymerase; twee strengen nodig om te binden
Primers
- 18-25 nucleotiden lang
- Hoog G-C gehalte (40-70%)
- Ongv. zelfde annealing temperatuur
- Geen baseparing tussen primer zelf of tussen twee primers (
- (mag niet omklappen, of forward & reverse binden
- Aplicon 75-200 bp. Hoogste efficiëntie
- Smelttemperatuur tussen 50 & 65 graden
Smelttemperatuur (Tm)
o Waar helft van DNA enkelstrengs is en andere helft dubbelstrengs
o Annealing temperatuur; iets onder Tm
Keuze gen & alignment
Primer
- Mag niet 100% gebonden zijn
- Mag losse 5’ kant hebben
- MAG NIET losse 3’ kant hebben
, Real time PCR
Lab vereisten
- Voor PCR detectie specifieke sequenties
- Specifieke technische handelingen, regenta & personeel
- Minimaal 3 verschillende ruimtes
Ruimte 1; maken master mixen, boven druk
Ruimte 2; ‘vieze lab’,toevoeging DNA aan mix ect.
Ruimte 3; PCR lab
‘Ruimte 4’; Aflees ruimte/ elektroforese
Voordelen
- Snelle werking; cycling times </=1,5 uur
- Hoge sample throughput (ongv. 200 monsters/dag)
- Heel gevoelig, in theorie; 1 dubbel strand DNA nodig om aan te tonen
- Detecteert kleinere verschillen tussen samples
- Grote dynamische range (10-10^10 copies)
- Reproduceerbaar
- Laag contaminatie risico
- Flexibele proefopzet
- Multiplex mogelijk (niet goed)
Meerdere targets 1 PCR
Nadelen
- Niet ideaal multiplexing
- Setup; vereiste technische vaardigheden & kennis
- Investering apparatuur
- Intra- & interassay variatie
- RNA instabiel
- DNA contaminatie (bij mRNA analyse)
Theorie PCR
- Product = 2^n cycli
- Amplificatie; exponentieel, toename; gelimiteerd
- Real-time PCR geeft mogelijkheid om exponentiële fase te zien
> Met Ct kan je hoeveelheid start materiaal berekenen
Ct-waarde
o Cyclusnummer waar signaal boven
vastgestelde drempelwaarde komt
Drie methoden om test te kwantificeren
- DNA-bindende stoffen (SYBR-green,
EvaGreen, LC Green)
- Hydrolyserende probes (TaqMan,
Beacons)
