Hoofdstuk 1: Algemene inleiding
1.1 Doel van de biochemische analyse
Biochemie
= studie van chemische processen in levende organismen
Doel: het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de cel
Voorbeelden:
- Structurele, kinetische en thermodynamische eigenschappen in een levend organisme
- Functie van moleculen en mechanismen waarmee ze andere moleculen herkennen met
vorming van anabolische, signalisatie, immunologische,... pathways in levende organismen
- Pathways verantwoordelijk voor synthese en degradatie van moleculen en mechanismen
verantwoordelijk voor de fouten in deze pathways
- Energetica van biologische processen (transport en uitwisseling)
- Opslag, replicatie, expressie, herstel, recombinatie en controle van genetische informatie
en ontstaan en ontwikkeling van cel specificiteit
Technieken die hierbij aan bod komen omvatten zowel
1. staalvoorbereiding
2. zuivering en isolatie van biocomponenten uit dit staal
3. identificatie, karakterisatie en kwantificatie van deze biocomponenten
Hoe? In vitro
+ eenvoudiger, gemakkelijker om te interpreteren
- minder overeenkomst met fysiologische situatie
Hoe? In vivo
1.2 Design van een biochemisch experiment (10 stappen)
Extra uitleg bij de verschillende stappen: kleine toepassing op het coronavirus
,Wat moeten we allemaal doen als we iets willen bestuderen, waar moeten we allemaal aan
denken
⇒ essentieel
Vraagstelling of hypothese, negatieve resultaten zijn ook goede resultaten omdat we zo veel zaken
kunnen uitsluiten
+ We moeten ook weten hoe we het extract van de preparatie gaan bereiden
Biologische systemen: er zijn veel verschillende mogelijkheden
→ vooral op basis van wat voorhanden is, het laboratorium waarin je werkt
→ gaan we longcellen isoleren uit de longen of gaan we ze juist niet extraheren, doen we
dit uit muizen of uit mensen, best uit mensen, maar dit is niet evident (je kan ook
stamcellen van longweefsel opzoeken, gebruik van een cellijn (tumorcel) die zich onbeperkt
laat groeien (mogelijks van leverweefsel, spiercellen, epitheel,... veel mogelijkheden)
→ deze komen ofwel van een bepaalde patient ofwel van een ander organisme
- we gaan dus preferentieel in vitro werken met een humaan specimen
Variabelen, je gaat één zaak doen variëren en al de rest moet constant blijven
vb. bij corona onderzoek je de initiële productie van het virus en ga je de andere variabelen
constant houden
→ de vraag is dan hoe ga je kijken naar de productie, een virale test, je kan ook
antilichamen gebruiken tegen het virus en hierna nagaan hoeveel virus er nog over is
(antilichaamtest), je kan ook via PCR de hoeveelheid van een DNA-sequentie meten,
dus PCR doen op een sequentie van een virus
⇒ in dit geval doen we fluorescentie met antilichamen, hoe meer antilichamen hoe minder virus
aanwezig
Opm. we moeten wel zien dat andere eiwitten niet gemerkt worden door de fluorescentie,
hiervoor hebben we controles nodig
Design: in welk laboratorium zitten we, bij corona zitten we in een virologisch laboratorium (dit is
een labo waar de lucht continu naar buiten gewerkt zodat moest er contaminatie zijn met het virus
dan zou dit meteen naar buiten worden gepompt, alles moet steriel zijn)
Uitvoering:
We zoeken een goede controle van het experiment, stel dat wanneer er een eiwit wordt behandeld
met een antivirale stof en dit ook een resultaat geeft maar dit dan een vals resultaat is, andere
eiwitten mogen niet fluorescent reageren
- we gaan deze cellen niet laten reageren met het virus, is er dan een resultaat, ja of nee
⇒ als je geen resultaat verwacht hebben we een negatieve controle
- Wat is een positieve controle, we zien fluorescentie als gevolg van het coronavirus, we
hebben een aparte celcultuur waarbij de cellen niet zijn behandeld met het virus waarvan
we liefst weten dat de cellen wel vatbaar kunnen zijn
Opm. kalibraties zijn ook belangrijk, de proef doen met verschillende concentraties van de cellen,
door meer cellen toe te voegen moet je meer resultaat hebben, calibreren om te weten hoeveel
virussen aanwezig zijn
==== er moeten ALTIJD controles aanwezig zijn
,Analyse van de resultaten met statistische testen, je moet bij alles statistische relevantie aantonen
vb. je zoekt een dosis respons curve en je ziet of deze valabel is met wat je verwacht, dit is
dus een extra controle → zo kan je dus controles gaan trekken
vb. bij die concentratie hebben deze cellen een antivirale activiteit, dan kan je de optimale
concentratie bepalen om het virus te gaan tegenwerken
hypothese: als je mag dromen over een ideale studie: Je laat een labo in china testen op mensen
nadat je op proefdieren klinische controles hebt gedaan
Enkele belangrijke opmerkingen:;
Neem continu notities, schrijf echt alles op, zo snel mogelijk nadat je het experiment hebt gedaan
Cyclus:
1. Vraagstelling + motivatie: wat en waarom?
2. Experimentele setup (inclusief controles), hoe voer je het experiment uit, dit duurt even
voor je het volledig hebt opgeschreven
3. Resultaten (grafieken, foto’s, tabellen…), je neemt foto’s, je maakt de grafieken, statistische
analyse,..., deze plak je in de notities, illustreer zoveel mogelijk later ga je het zo veel
gemakkelijker hebben
4. Analyse + statistiek, berekeningen worden uitgevoerd
5. Bespreken van de meest opvallende zaken uit de resultaten, je bespreekt de meest
opvallende zaken, je kan ook een bespreking maken over de controles
6. Conclusie
7. Verdere experimenten -> link met volgende “cyclus”: punt 1, de volgende cyclus begint met
vraagstelling en motivatie, je begint het volgende experiment met de conclusie van het
volgende experiment
⇒ er mogen dingen mislukken zolang je er maar uit leert en ze niet nog eens gebeuren
Soorten controles:
Opm. Controles steeds meenemen, anders is het experiment waardeloos!
- Positieve controle: nagaan of het testsysteem werkt. Belangrijk als resultaat negatief is.
- Negatieve controle: nagaan of het resultaat louter en alleen het gevolg is van de test (bv.
geen contaminatie). Belangrijk wanneer resultaat positief is.
- Andere controles: bv. op parameters die moeilijk gelijk te houden zijn, vergelijking met
andere stalen, voor normalisatie (bv. met eenzelfde experiment dat wordt uitgevoerd op
ander tijdstip), etc
⇒ normalisaties zijn steeds belangrijk, je gebruikt controles die exact dezelfde condities hebben
met de voorgaande experimenten
Er gaat heel veel onderzoek verloren door het niet correct toepassen van de vorige
stappenplannen
,1.3 Meeteenheden:
SI Units (Système Internationales d’Unités): algemeen aanvaarde eenheden. Deze kunnen
geconverteerd worden naar andere units of door conversie uit andere units verkregen worden.
⇒ niet van buiten kennen, informatief
1.4 Oplossingen: Concentraties
Oplossing = homogeen mengsel van één of meerdere substanties/solutes in een vloeibare
component (solvent)
- De concentratie van de substanties in de oplossing geeft de hoeveelheid weer van elke
substantie in een bepaalde hoeveelheid (gewicht of volume) solvent:
,1.5 Oplossingen: Het begrip Molariteit
- 1 mol= De hoeveelheid van een substantie die 6,022.1023 moleculen bevat (Avogadro)
- Moleculaire massa/MW = Het aantal dalton (één dalton= 1/12 v/d massa v/e 12C atoom)
- Relatieve moleculaire massa/Mr = de moleculaire massa van een substantie relatief tot 1/12
van de atoommassa van 12C
⇒ in de praktijk geldt: MW=Mr, alleen heeft deze laatste geen eenheid omdat het relatief is
Praktijk: 1 mol van een substantie is de MW (som van de atomaire massa's van die
substantie in gram uitgedrukt)
SI voor concentratie: mol/m³ maar voor biochemische toepassing: mol/dm³ = mol/liter = Molariteit
Aangezien biologische substanties gewoonlijk bij relatief lage concentraties voorkomen en de
volumes ook vrij klein zijn en de volumes klein zijn, liggen de experimentele oplossingen eerder in
het mmol/dm³ (mM), 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑑𝑚³ (𝜇𝑀), nmol/dm³ (nM)
Verdunningen: dit maakt men uit hoger geconcentreerde oplossingen met het gebruik van de
formule M1 . V1 = M2 . V2 waarbij M1 en M2 de initiële en finale molariteiten voorstellen en V1 en V2
initiële en finale volumes
⇒ er zijn dus 3 variabelen bekend en de derde wordt bepaald
,Elektrolyten: Ionaire concentratie of ionaire activiteit? Ionische sterkte: 𝜇 𝑜𝑓 𝐼
Ionisatie= uiteenvallen in ionen, vb. Na+ Cl- in waterige oplossing
- Sterke elektrolyten: irreversibele ionisatie. Is mogelijk omdat Na en Cl niet door covalente,
maar ionaire binding bij elkaar wordt gehouden
- Zwakke elektrolyten: reversibele ionisatie. vb. carboxylgroep: O-H is covalente verbinding
echter H is partieel positief (gedeeltelijk positieve lading is reeds aanwezig)
→ Bovendien kan bij afsplitsing het vrije elektron gedelokaliseerd worden over de twee
zuurstof atomen waardoor het carboxyl anion relatief gestabiliseerd wordt tegenover de
carboxylgroep, dus stimuleert ionisatie
- Non-electrolyten: geen ionisatie (bv. alcoholen zoals glucose)
Als zowel sterke als zwakke elektrolyten worden gebruikt is het beter de hoeveelheid individuele
ionen te meten in oplossing, dan de concentratie van de componenten waaruit ze zijn ontstaan.
z = de lading van de ionen
→ Zouten die monovalente ionen vormen ioniseren nagenoeg volledig in water.
→ Zouten die divalente ionen vormen (bv. MgSO4 → Mg2+ + SO42-) vertonen ionpairing
= de ionen worden tot elkaar aangetrokken in waterige oplossing zodat ze toch een
ionbinding in water vormen
vb. 0.25M MgSO4 is voor slechts 65% geïoniseerd, de rest bestaat als ionenparen.
Ionen worden omgeven door tegenionen (kan ook water zijn vanwege polair karakter)
→ reductie van effectieve lading van centrale ion. Dit effect vergroot bij verhoogde ionen sterkte.
, Activiteiten en activiteitscoëfficiënten van ioniseerbare componenten:
- Alle berekeningen van equilibrium reacties waarbij gebruik wordt gemaakt van ionen
concentraties zijn in principe fout.
Reden: Ionen zijn geladen en interageren waardoor ze aantrekken en afstoten (Coulombkrachten)
⇒ Deze interacties beïnvloeden het gedrag van ionen en laten niet toe elk ion in
oplossing afzonderlijk te behandelen
Gevolg: in evenwicht berekeningen gebruiken we beter “ionen activiteiten” i.p.v. concentraties
M.a.w. de ionische sterkte beïnvloedt de effectieve concentratie van een ioniseerbare stof waarbij
de effectieve concentratie (‘Activity’) in verband staat met de nominale concentratie door de
activiteitscoëfficiënt (γ):
Ax = [X] γx
- AX is de activiteit van de stof X
- [X] is de nominale concentratie van X
- γx is de activiteitscoëfficiënt van X
⇒ de activiteitscoëfficiënt is een maat voor de afwijking van het ionisatiegedrag van de stof als
gevolg van de ionische sterkte.
→ Wanneer µ stijgt daalt γx waardoor de activiteit daalt tegenover de concentratie
Algemeen: de concentraties bij biochemische experimenten zijn vrij laag zodat activiteit en
concentratie nagenoeg samenvallen maar indien nodig kan γx uit tabellen bekomen worden
1.1 Doel van de biochemische analyse
Biochemie
= studie van chemische processen in levende organismen
Doel: het begrijpen van het moleculaire werkingsmechanisme van de cel
Voorbeelden:
- Structurele, kinetische en thermodynamische eigenschappen in een levend organisme
- Functie van moleculen en mechanismen waarmee ze andere moleculen herkennen met
vorming van anabolische, signalisatie, immunologische,... pathways in levende organismen
- Pathways verantwoordelijk voor synthese en degradatie van moleculen en mechanismen
verantwoordelijk voor de fouten in deze pathways
- Energetica van biologische processen (transport en uitwisseling)
- Opslag, replicatie, expressie, herstel, recombinatie en controle van genetische informatie
en ontstaan en ontwikkeling van cel specificiteit
Technieken die hierbij aan bod komen omvatten zowel
1. staalvoorbereiding
2. zuivering en isolatie van biocomponenten uit dit staal
3. identificatie, karakterisatie en kwantificatie van deze biocomponenten
Hoe? In vitro
+ eenvoudiger, gemakkelijker om te interpreteren
- minder overeenkomst met fysiologische situatie
Hoe? In vivo
1.2 Design van een biochemisch experiment (10 stappen)
Extra uitleg bij de verschillende stappen: kleine toepassing op het coronavirus
,Wat moeten we allemaal doen als we iets willen bestuderen, waar moeten we allemaal aan
denken
⇒ essentieel
Vraagstelling of hypothese, negatieve resultaten zijn ook goede resultaten omdat we zo veel zaken
kunnen uitsluiten
+ We moeten ook weten hoe we het extract van de preparatie gaan bereiden
Biologische systemen: er zijn veel verschillende mogelijkheden
→ vooral op basis van wat voorhanden is, het laboratorium waarin je werkt
→ gaan we longcellen isoleren uit de longen of gaan we ze juist niet extraheren, doen we
dit uit muizen of uit mensen, best uit mensen, maar dit is niet evident (je kan ook
stamcellen van longweefsel opzoeken, gebruik van een cellijn (tumorcel) die zich onbeperkt
laat groeien (mogelijks van leverweefsel, spiercellen, epitheel,... veel mogelijkheden)
→ deze komen ofwel van een bepaalde patient ofwel van een ander organisme
- we gaan dus preferentieel in vitro werken met een humaan specimen
Variabelen, je gaat één zaak doen variëren en al de rest moet constant blijven
vb. bij corona onderzoek je de initiële productie van het virus en ga je de andere variabelen
constant houden
→ de vraag is dan hoe ga je kijken naar de productie, een virale test, je kan ook
antilichamen gebruiken tegen het virus en hierna nagaan hoeveel virus er nog over is
(antilichaamtest), je kan ook via PCR de hoeveelheid van een DNA-sequentie meten,
dus PCR doen op een sequentie van een virus
⇒ in dit geval doen we fluorescentie met antilichamen, hoe meer antilichamen hoe minder virus
aanwezig
Opm. we moeten wel zien dat andere eiwitten niet gemerkt worden door de fluorescentie,
hiervoor hebben we controles nodig
Design: in welk laboratorium zitten we, bij corona zitten we in een virologisch laboratorium (dit is
een labo waar de lucht continu naar buiten gewerkt zodat moest er contaminatie zijn met het virus
dan zou dit meteen naar buiten worden gepompt, alles moet steriel zijn)
Uitvoering:
We zoeken een goede controle van het experiment, stel dat wanneer er een eiwit wordt behandeld
met een antivirale stof en dit ook een resultaat geeft maar dit dan een vals resultaat is, andere
eiwitten mogen niet fluorescent reageren
- we gaan deze cellen niet laten reageren met het virus, is er dan een resultaat, ja of nee
⇒ als je geen resultaat verwacht hebben we een negatieve controle
- Wat is een positieve controle, we zien fluorescentie als gevolg van het coronavirus, we
hebben een aparte celcultuur waarbij de cellen niet zijn behandeld met het virus waarvan
we liefst weten dat de cellen wel vatbaar kunnen zijn
Opm. kalibraties zijn ook belangrijk, de proef doen met verschillende concentraties van de cellen,
door meer cellen toe te voegen moet je meer resultaat hebben, calibreren om te weten hoeveel
virussen aanwezig zijn
==== er moeten ALTIJD controles aanwezig zijn
,Analyse van de resultaten met statistische testen, je moet bij alles statistische relevantie aantonen
vb. je zoekt een dosis respons curve en je ziet of deze valabel is met wat je verwacht, dit is
dus een extra controle → zo kan je dus controles gaan trekken
vb. bij die concentratie hebben deze cellen een antivirale activiteit, dan kan je de optimale
concentratie bepalen om het virus te gaan tegenwerken
hypothese: als je mag dromen over een ideale studie: Je laat een labo in china testen op mensen
nadat je op proefdieren klinische controles hebt gedaan
Enkele belangrijke opmerkingen:;
Neem continu notities, schrijf echt alles op, zo snel mogelijk nadat je het experiment hebt gedaan
Cyclus:
1. Vraagstelling + motivatie: wat en waarom?
2. Experimentele setup (inclusief controles), hoe voer je het experiment uit, dit duurt even
voor je het volledig hebt opgeschreven
3. Resultaten (grafieken, foto’s, tabellen…), je neemt foto’s, je maakt de grafieken, statistische
analyse,..., deze plak je in de notities, illustreer zoveel mogelijk later ga je het zo veel
gemakkelijker hebben
4. Analyse + statistiek, berekeningen worden uitgevoerd
5. Bespreken van de meest opvallende zaken uit de resultaten, je bespreekt de meest
opvallende zaken, je kan ook een bespreking maken over de controles
6. Conclusie
7. Verdere experimenten -> link met volgende “cyclus”: punt 1, de volgende cyclus begint met
vraagstelling en motivatie, je begint het volgende experiment met de conclusie van het
volgende experiment
⇒ er mogen dingen mislukken zolang je er maar uit leert en ze niet nog eens gebeuren
Soorten controles:
Opm. Controles steeds meenemen, anders is het experiment waardeloos!
- Positieve controle: nagaan of het testsysteem werkt. Belangrijk als resultaat negatief is.
- Negatieve controle: nagaan of het resultaat louter en alleen het gevolg is van de test (bv.
geen contaminatie). Belangrijk wanneer resultaat positief is.
- Andere controles: bv. op parameters die moeilijk gelijk te houden zijn, vergelijking met
andere stalen, voor normalisatie (bv. met eenzelfde experiment dat wordt uitgevoerd op
ander tijdstip), etc
⇒ normalisaties zijn steeds belangrijk, je gebruikt controles die exact dezelfde condities hebben
met de voorgaande experimenten
Er gaat heel veel onderzoek verloren door het niet correct toepassen van de vorige
stappenplannen
,1.3 Meeteenheden:
SI Units (Système Internationales d’Unités): algemeen aanvaarde eenheden. Deze kunnen
geconverteerd worden naar andere units of door conversie uit andere units verkregen worden.
⇒ niet van buiten kennen, informatief
1.4 Oplossingen: Concentraties
Oplossing = homogeen mengsel van één of meerdere substanties/solutes in een vloeibare
component (solvent)
- De concentratie van de substanties in de oplossing geeft de hoeveelheid weer van elke
substantie in een bepaalde hoeveelheid (gewicht of volume) solvent:
,1.5 Oplossingen: Het begrip Molariteit
- 1 mol= De hoeveelheid van een substantie die 6,022.1023 moleculen bevat (Avogadro)
- Moleculaire massa/MW = Het aantal dalton (één dalton= 1/12 v/d massa v/e 12C atoom)
- Relatieve moleculaire massa/Mr = de moleculaire massa van een substantie relatief tot 1/12
van de atoommassa van 12C
⇒ in de praktijk geldt: MW=Mr, alleen heeft deze laatste geen eenheid omdat het relatief is
Praktijk: 1 mol van een substantie is de MW (som van de atomaire massa's van die
substantie in gram uitgedrukt)
SI voor concentratie: mol/m³ maar voor biochemische toepassing: mol/dm³ = mol/liter = Molariteit
Aangezien biologische substanties gewoonlijk bij relatief lage concentraties voorkomen en de
volumes ook vrij klein zijn en de volumes klein zijn, liggen de experimentele oplossingen eerder in
het mmol/dm³ (mM), 𝜇𝑚𝑜𝑙/𝑑𝑚³ (𝜇𝑀), nmol/dm³ (nM)
Verdunningen: dit maakt men uit hoger geconcentreerde oplossingen met het gebruik van de
formule M1 . V1 = M2 . V2 waarbij M1 en M2 de initiële en finale molariteiten voorstellen en V1 en V2
initiële en finale volumes
⇒ er zijn dus 3 variabelen bekend en de derde wordt bepaald
,Elektrolyten: Ionaire concentratie of ionaire activiteit? Ionische sterkte: 𝜇 𝑜𝑓 𝐼
Ionisatie= uiteenvallen in ionen, vb. Na+ Cl- in waterige oplossing
- Sterke elektrolyten: irreversibele ionisatie. Is mogelijk omdat Na en Cl niet door covalente,
maar ionaire binding bij elkaar wordt gehouden
- Zwakke elektrolyten: reversibele ionisatie. vb. carboxylgroep: O-H is covalente verbinding
echter H is partieel positief (gedeeltelijk positieve lading is reeds aanwezig)
→ Bovendien kan bij afsplitsing het vrije elektron gedelokaliseerd worden over de twee
zuurstof atomen waardoor het carboxyl anion relatief gestabiliseerd wordt tegenover de
carboxylgroep, dus stimuleert ionisatie
- Non-electrolyten: geen ionisatie (bv. alcoholen zoals glucose)
Als zowel sterke als zwakke elektrolyten worden gebruikt is het beter de hoeveelheid individuele
ionen te meten in oplossing, dan de concentratie van de componenten waaruit ze zijn ontstaan.
z = de lading van de ionen
→ Zouten die monovalente ionen vormen ioniseren nagenoeg volledig in water.
→ Zouten die divalente ionen vormen (bv. MgSO4 → Mg2+ + SO42-) vertonen ionpairing
= de ionen worden tot elkaar aangetrokken in waterige oplossing zodat ze toch een
ionbinding in water vormen
vb. 0.25M MgSO4 is voor slechts 65% geïoniseerd, de rest bestaat als ionenparen.
Ionen worden omgeven door tegenionen (kan ook water zijn vanwege polair karakter)
→ reductie van effectieve lading van centrale ion. Dit effect vergroot bij verhoogde ionen sterkte.
, Activiteiten en activiteitscoëfficiënten van ioniseerbare componenten:
- Alle berekeningen van equilibrium reacties waarbij gebruik wordt gemaakt van ionen
concentraties zijn in principe fout.
Reden: Ionen zijn geladen en interageren waardoor ze aantrekken en afstoten (Coulombkrachten)
⇒ Deze interacties beïnvloeden het gedrag van ionen en laten niet toe elk ion in
oplossing afzonderlijk te behandelen
Gevolg: in evenwicht berekeningen gebruiken we beter “ionen activiteiten” i.p.v. concentraties
M.a.w. de ionische sterkte beïnvloedt de effectieve concentratie van een ioniseerbare stof waarbij
de effectieve concentratie (‘Activity’) in verband staat met de nominale concentratie door de
activiteitscoëfficiënt (γ):
Ax = [X] γx
- AX is de activiteit van de stof X
- [X] is de nominale concentratie van X
- γx is de activiteitscoëfficiënt van X
⇒ de activiteitscoëfficiënt is een maat voor de afwijking van het ionisatiegedrag van de stof als
gevolg van de ionische sterkte.
→ Wanneer µ stijgt daalt γx waardoor de activiteit daalt tegenover de concentratie
Algemeen: de concentraties bij biochemische experimenten zijn vrij laag zodat activiteit en
concentratie nagenoeg samenvallen maar indien nodig kan γx uit tabellen bekomen worden
