BLOK 2 les 1:
Thrombine site wordt ingebouwd en hier kunnen proteases het GST eiwit losknippen van IDH1. Dit is
geknipt van het geproduceerde eiwit, dus niet uit de plasmide.
Je moet rekening houden (bij eiwitexpressie) met..
De voordelen: E. coli is goedkoop, makkelijk aan te passen en groeien snel.
De nadelen: Codon bias, verkeerd gevouwde eiwitten, postranslationele modificatie
Codon bias ‘hoeveelheid dat een codon voorkomt’:
een codon van 3 nucleotiden wordt omgezet in 1
aminozuur. Zo kan een bepaald codon vaker
voorkomen dan een ander. Bijvoorbeeld arginine is
de codon AGA in humane cellen, echter heeft E. coli
vaker de codon CGU voor arginine. Er zijn dus weinig
tRNA’s die AGA coderen voor arginine en veel voor
CGU.
Eiwitvouwing (misfolding): door heterogene expressie is er een grote kans op verkeerd gevouwen
eiwitten. Verkeerd gevouwen eiwitten hopen zich op in inclusielichamen (uiteindelijk in de celpellet)
Les 2: om eiwit tot expressie te brengen moet je bacterie induceren. 2 dingen moeten gebeuren
voordat transcriptie van IDH1 kan plaatsvinden… namelijk:
Repressor eiwit (LacI of AraC) moet van operator sequentie af en RNA polymerase moet expressed
worden en binden aan promotor (T7 /tac/araBAD)
In het lab wordt geinduceerd met IPTG of arabinose, er wordt mid-log fase (groeifase) voor E.coli
gekozen om dat de cellen dan actief zijn en bereid zijn om eiwit tot expressie te brengen
Hoeveel van de IPTG of arabinose (inducer) voeg je toe? Te veel kost veel geld
en kan ook negatief werken. Verder kost het veel tijd.
Het eerste wat je moet weten is welke concentratie je toevoegd van inducer
molecuul. Hier kun je achter komen door verschillende samples verschillende
, concentraties toe te voegen. Alle andere omstandigheden blijven gelijk. Hier valt ook te zien dat je
productie afneemt bij een te lage of te hoge concentratie IPTG. Hier zou gekozen kunnen worden
voor 64 uM IPTG.
Hoe lang laat je dit inducer molecuul in het sample, wat is de optimale
inductie tijd? Opnieuw wordt hetzelfde experiment toegevoegd maar dan
met 1 concentratie inducer molecuul, en bij diverse tijden. Hier zou de
goede keuze 18 uur zijn.
Eiwitisolatie en zuivering
Celdisruptie/lyse manieren en nadelen
Het doel van deze manieren is het
verstoren van gedeelte van de celwand
of gehele cell om biologische moleculen
vrij te laten komen, zoals eiwitten
Ultrasonicatie (wordt gebruikt tijdens praktijk), hier wordt
een naald in de sample gestoken en geeft micro-
geluidsgolfen af. Door de geluidsgolven ontstaan er
gasbelletjes die continu krimpen en groter groeien. Als het groot genoeg is imploseert het. Er
ontstaat een hotspot (hoge druk plek/scheurkrachten die sample uit elkaar scheuren, er is wel een
hele hoge temperatuur wat een nadeel is). Omdat het heet wordt moet sample continu op ijs blijven
staan.
De vervuilingen willen we er niet bij. Dus celresten kwijt raken door centrifugeren. Het eiwit zal dan
in het supernatant (want oplosbaar, kleine moleculen zitten daar die niet neerslaan), en de pellet zit
de bacterieresten dit mag weg (hier kunnen ook misvouwingen zitten van eiwitten, dan slaan ze neer
en komen ze in het pellet= verkeerd gegaan, eiwitproduct is dan weg) :(
Een eiwit moet onder goede condities bewaard blijven om te werken, het
is daarom best lastig om mee te werken want instabiel. Moet op ijs staan
want te hoge temperatuur= denaturatie (minder H-bindingen, eiwit
ontvouwt). Ook is het pH sensitief, pH kan de vorm van eiwitten
veranderen of ionische bindingen of H-bruggen beinvloeden.
Kort gezegd: denaturatie (ontvouwing), structuur
verlies je. Het kan (on)omkeerbaar zijn afhankelijk van
de situaties. Ook afhankelijk van de vouwing kunnen
eiwitten juist meer of minder oplosbaar zijn.
Met oplosbaarheid valt te spelen, namelijk salting.
• Inzouten: lage concentraties zouten verhoogt de oplosbaarheid van eiwitten
door de eiwit-eiwit-interacties te onderdrukken
• Uitzouten: hoge concentraties zouten verminderen de oplosbaarheid van
eiwitten door ionen hydratatie van zouten, zoutionen trekken watermoleculen
aan.
(neerslaan van eiwit), vaak gekozen hiervoor: Ammioniumsulfaat (NH4)2SO4
Thrombine site wordt ingebouwd en hier kunnen proteases het GST eiwit losknippen van IDH1. Dit is
geknipt van het geproduceerde eiwit, dus niet uit de plasmide.
Je moet rekening houden (bij eiwitexpressie) met..
De voordelen: E. coli is goedkoop, makkelijk aan te passen en groeien snel.
De nadelen: Codon bias, verkeerd gevouwde eiwitten, postranslationele modificatie
Codon bias ‘hoeveelheid dat een codon voorkomt’:
een codon van 3 nucleotiden wordt omgezet in 1
aminozuur. Zo kan een bepaald codon vaker
voorkomen dan een ander. Bijvoorbeeld arginine is
de codon AGA in humane cellen, echter heeft E. coli
vaker de codon CGU voor arginine. Er zijn dus weinig
tRNA’s die AGA coderen voor arginine en veel voor
CGU.
Eiwitvouwing (misfolding): door heterogene expressie is er een grote kans op verkeerd gevouwen
eiwitten. Verkeerd gevouwen eiwitten hopen zich op in inclusielichamen (uiteindelijk in de celpellet)
Les 2: om eiwit tot expressie te brengen moet je bacterie induceren. 2 dingen moeten gebeuren
voordat transcriptie van IDH1 kan plaatsvinden… namelijk:
Repressor eiwit (LacI of AraC) moet van operator sequentie af en RNA polymerase moet expressed
worden en binden aan promotor (T7 /tac/araBAD)
In het lab wordt geinduceerd met IPTG of arabinose, er wordt mid-log fase (groeifase) voor E.coli
gekozen om dat de cellen dan actief zijn en bereid zijn om eiwit tot expressie te brengen
Hoeveel van de IPTG of arabinose (inducer) voeg je toe? Te veel kost veel geld
en kan ook negatief werken. Verder kost het veel tijd.
Het eerste wat je moet weten is welke concentratie je toevoegd van inducer
molecuul. Hier kun je achter komen door verschillende samples verschillende
, concentraties toe te voegen. Alle andere omstandigheden blijven gelijk. Hier valt ook te zien dat je
productie afneemt bij een te lage of te hoge concentratie IPTG. Hier zou gekozen kunnen worden
voor 64 uM IPTG.
Hoe lang laat je dit inducer molecuul in het sample, wat is de optimale
inductie tijd? Opnieuw wordt hetzelfde experiment toegevoegd maar dan
met 1 concentratie inducer molecuul, en bij diverse tijden. Hier zou de
goede keuze 18 uur zijn.
Eiwitisolatie en zuivering
Celdisruptie/lyse manieren en nadelen
Het doel van deze manieren is het
verstoren van gedeelte van de celwand
of gehele cell om biologische moleculen
vrij te laten komen, zoals eiwitten
Ultrasonicatie (wordt gebruikt tijdens praktijk), hier wordt
een naald in de sample gestoken en geeft micro-
geluidsgolfen af. Door de geluidsgolven ontstaan er
gasbelletjes die continu krimpen en groter groeien. Als het groot genoeg is imploseert het. Er
ontstaat een hotspot (hoge druk plek/scheurkrachten die sample uit elkaar scheuren, er is wel een
hele hoge temperatuur wat een nadeel is). Omdat het heet wordt moet sample continu op ijs blijven
staan.
De vervuilingen willen we er niet bij. Dus celresten kwijt raken door centrifugeren. Het eiwit zal dan
in het supernatant (want oplosbaar, kleine moleculen zitten daar die niet neerslaan), en de pellet zit
de bacterieresten dit mag weg (hier kunnen ook misvouwingen zitten van eiwitten, dan slaan ze neer
en komen ze in het pellet= verkeerd gegaan, eiwitproduct is dan weg) :(
Een eiwit moet onder goede condities bewaard blijven om te werken, het
is daarom best lastig om mee te werken want instabiel. Moet op ijs staan
want te hoge temperatuur= denaturatie (minder H-bindingen, eiwit
ontvouwt). Ook is het pH sensitief, pH kan de vorm van eiwitten
veranderen of ionische bindingen of H-bruggen beinvloeden.
Kort gezegd: denaturatie (ontvouwing), structuur
verlies je. Het kan (on)omkeerbaar zijn afhankelijk van
de situaties. Ook afhankelijk van de vouwing kunnen
eiwitten juist meer of minder oplosbaar zijn.
Met oplosbaarheid valt te spelen, namelijk salting.
• Inzouten: lage concentraties zouten verhoogt de oplosbaarheid van eiwitten
door de eiwit-eiwit-interacties te onderdrukken
• Uitzouten: hoge concentraties zouten verminderen de oplosbaarheid van
eiwitten door ionen hydratatie van zouten, zoutionen trekken watermoleculen
aan.
(neerslaan van eiwit), vaak gekozen hiervoor: Ammioniumsulfaat (NH4)2SO4
