Samenvatting moleculaire- en biochemische technieken course 5 blok 1

Samenvatting moleculaire- en biochemische technieken



PCR

- Kan alleen op DNA
- DNA replicatie in een epje
- Master mix (pipeteer mix)
o DNA primers (forward en reverse)
o DNA template
o Nucleotiden nodig (DNTP)
o Cofactoren nodig (MgCl2)
(Magnesion is de cofactor)
o DNA polymerase
o Buffer voor stabiele pH
- PCR reactie
o Aan 3 accent einde gaat DNA
polymerase nieuwe nucleotiden
koppelen
o Van 5 naar 3 accent



Stappen van de PCR

- Stap 1: denaturatie
o Hoge temperatuur omdat zo de dubbele helix loslaat
o 95 graden
- Stap 2: Annealing
o Forward en reverse primer kunnen gaan binden
o Van 5 naar 3 kan DNA polymerase nieuwe nucleotiden gaan binden
o 50 tot 60 graden
 5 graden onder smelttemperatuur van primer
- Stap 3: Elongatie
o Synthetiseren van DNA
o TAG polymerase
o 72 graden
o Tijd berekenen


DNA template

- Bevat DNA fragmenten die amplified kunnen worden
o Plasmide DNA
 Bacterieel
o Genomisch DNA
 Bevat intronen
o cDNA
- Template DNA niet te veel en niet te weinig toevoegen
o Geen of teveel reacties
- DNA is helemaal gedenatureerd om het enkelstrengs te maken

, DNA polymerase

- TAG DNA polymerase
o DNA polymerase die geïsoleerd is uit thermus aquaticus
o Nadeel: Heeft geen proofreading
- Pfu DNA polymerase
o Heeft wel proofreading
o Handig als er een gen tot expressie wordt gebracht


Forward en reverse primers

- Nodig om DNA polymerase van nieuwe 3 accent einde te voorzien
- Goede primers nodig
o Primer plaatsen aan het 3 accent einde van het DNA
o Bovenste streng reverse primers
o Onderste streng forward primer
- Primers 18 tot 24 nucleotides lang
o Minder is niet specifiek
o Annealing temperatuur zorgt er voor dat de primer alleen specifiek zal binden
- Condities
o CG content van 50 tot 60%
o 3 einde moet een C of G bevatten
o Niet langer dan 24 nucleoides
o Verschil tussen primers 1 tot 2kb
o Verschillende smelttemperaturen binnen 5 graden verschil van elkaar
o Smelttemperatuur onder 70 graden
- Smelttemperatuur
o Temperatuur die nodig is om de DNA duplex uit elkaar te halen
 Primer van template af te halen
o Bepaald door aantal binden AT en GC
 GC kost meer energie en hogere smelttemperatuur
 AT kost minder energie
o Tm= 4(C+G) + 2(A+T)
o Het maximale temperatuurverschil mag 5 graden zijn
o Annealing temperatuur
 Ta= Tm – 2 tot 5 graden


Primers

- Te korte primer
o Niet specifiek genoeg
o Grote kans op meer hechtingsplaatsen
- Te lange primer
o Dan wordt de smelttemperatuur hoger
o Hogere annealing temperatuur
o Niet handig omdat deze op elongatie temperatuur gaat lijken
- Primer design