Samenvatting Moleculaire en biochemische technieken course 5 blok 2

Samenvatting moleculaire en biochemische technieken



Plasmides




pBAD/HIS vector

- pBAD/HIS
o AraC
o pBAD promotor
o 6x HIS tag
- Zonder inductie
o AraC bind aan AraI en AraO site waardoor promotor niet kan binden
o Er komt geen IDH-1 tot expressie
- Met arabinose
o RNA polymerase wordt gemaakt en bind aan promotor
o AraC eiwit wordt ook gemaakt
o Induceren met arabinose
o AraC bind aan de inducer sites
o RNA polymerase kan aan promotor binden
o De HIS tag zit aan het IDH-1
o Je krijgt de tag HIS (6 aminozuren)




Zonder inductie Met inductie

,pGEX-4T1 vector

- LacI en Lac operator
o Inducer is IPTG
- TAG promotor
- GST tag wat aan het IDH-1 gaat binden
- Zonder inductie
o LacI codeerdt voor Lac reprossor eiwitten
 Binden aan Lac operator waardoor er geen transcriptie kan plaatsvinden
o TAG promotor kan niet binden
- Met IPTG
o IPTG zal binden aan lac repressor eiwitten waardoor deze geblokkeerd zijn
o Nu kan de tag promotor binden
o Eerst wordt GST getransleerd en daarna MCS met het IDH-1 eiwit
o Je krijgt dus het GST fusie eiwit




Zonder inductie Met inductie



pET-15b

- BL21 cellen werken het beste met deze vector
- LacI en LacO
o LacI promotor
- T 7 promotor
- Onder inductie
o RNA polymerase wordt gemaakt
o Zal aan LAcI promotor binden maar lac repressie eiwit wordt gemaakt waardoor het
niet tot expressie komt
- Met IPTG
o IPTG bind aan lac repressie eiwitten
o In het genoom van de bacterie wordt ook LacI tot expressie gebracht
o RNA polymerase zal aan 2 promotoor binden
o T7 RNA polymerase wordt gemaakt
o 2e promotor in vector wordt geactiveerd door T7 RNA polymerase
o Nu komt IDH-1 tot expressie

, Zonder inductie Met inductie



pLysS vooral in pET-15b

- Amp en chloramphenicol
- Gen op T7 lysosomen te maken
o Lysosym komt altijd tot expressie
- Geen MCS
- Functie is het maken van lysozym
- Zonder inductie
o pLys blokkeert T7 RNA polymerase om
zo achtergrondexpressie te blokkeren
o T7 lysozym inactiveert T7 RNA
polymerase
- Inductie
o Repressors worden weggevangen
o T7 RNA polymerase wordt gemaakt en
kan aan T7 promotor binden
o IDH-1 wordt gemaakt
o Lysosym is er nog maar kan niet alle RNA polymerase wegvangen