LABORATORY TOOLS
LES 1: BASISBEGRIPPEN VOOR
SCHEIDINGSMETHODEN, GELFILTRATIE EN
AFFINITEITSCHROMATOGRAFIE
Chromatografie: affiniteit voor mobiele of stationaire fase. Bij chromatografie heb
je een stationaire fase (vast of vloeibaar) en een mobiele fase (deze loopt langs
de stationaire fase, vloeibaar of gas). Stoffen met een hoge affiniteit (die dus wel
goed binden) voor de stationaire fase komen vertraagd van de kolom.
Preparatieve chromatografie: zuivering waarbij het product intact blijft.
Analytische chromatografie: zuivering waarbij hoeft het product niet intact hoeft
te blijven.
Kolomchromatografie heeft een glazen kolom. Bij de
computer komt er een chromatogram uit. Hierbij heb je de
hoogte, breedte en de retentietijd die van belang zijn. De
dode tijd (t0) is de tijd die nodig is voor de mobiele fase om
de kolom te verlaten. De retentietijd is de tijd tussen
injecteren van het monster en het midden van de piek van
het eluaat (dat wat van de kolom af komt). Bruto retentie tijd
is met dode tijd en de netto retentie tijd is zonder de dode tijd. De oppervlakte in
onder een piek zegt iets over hoeveel stof er aanwezig is. Hiermee kun je
rekenen:
1. De selectiviteit, het verschil in retentietijd:
α = (tb – t0) / (ta – t0)
2. De resolutie, de verhouding tussen de breedte van de kolom en de tijd
R = 2(ta – tb) / (Wa + Wb)
3. Efficiëntie, maat voor aantal pieken dat naast elkaar van je kolom af kan
komen = schotelgetal. Hoe hoger, hoe beter de scheiding. Dit kun je
verhogen door de lengte van de kolom te verlengen, de kwaliteit van
kolom materiaal te verbeteren, kleinere deeltjes te gebruiken en te zorgen
voor constante doorloopsnelheid.
Diffusie: bredere banden breder en mindere scheiding. Bij hogere elutiesnelheid
is er minder diffusie en dus betere scheiding. Daarom worden vaak hogedruk
pompen gebruikt:
o HPLC (high-performance liquid chromatography)
De eluens (loopvloeistof) kun je isocratisch (de mobiele fase heeft dan een
constante concentratie) en gradiënt (de mobiele fase heeft dan een
variërende concentratie) er
doorheen pompen. De
, detectors meten vervolgens of er stofjes langskomen. Dit is onder hoge
druk en voor kleine biologische moleculen.
o FPLC (fast protein liquid chromatography)
Dit is onder lagere druk, omdat het voor grotere moleculen is, zoals
eiwitten, die anders denatureren.
Gaschromatografie: de mobiele fase is een gas. De stationaire fase is een
vloeistof. Je hebt ook hier een druk regulator, detector een computer. De kolom
hiervan is vaak langer.
Affiniteitschromatografie: scheiding op basis van biospecificiteit, sleutel-slot-
principe. Als een mix van eiwitten wordt opgebracht, bindt alleen het eiwit dat
specifieke affiniteit heeft met de ligand. De overige eiwitten zullen niet binden en
worden weggewassen met de buffer. Vervolgens ga je
de kolom elueren. We onderscheiden 4 methodes
daarvoor:
1. Verandering van condities zoals pH en
zoutconcentratie.
2. Eiwit denaturatie.
3. Competitie met het eiwit voor binding op de
kolom.
4. Competitie voor binding aan het eiwit.
Affiniteitschromatografie met behulp van antilichamen
Op een kolom waar een eiwit aan is gebonden die sterk antilichamen kan binden,
wordt een antilichaam (eiwit dat specifiek aan een andere stof kan binden)
gebracht tegen het eiwit dat gezuiverd moet worden. Het te zuiveren eiwit wordt
gebonden door het antilichaam en de andere eiwitten worden van de kolom
gewassen. Geëlueerd kan worden door de pH kort te verlagen wat leidt tot het
verbreken van de antigeen-antilichaam binding.
Affiniteitschromatografie met behulp van “eiwit-tags”
Op DNA-niveau kan er een stukje DNA worden toegevoegd coderend (tag) voor
een eiwit wat men wil zuiveren. Het eiwit wordt vervolgens tot expressie
gebracht in een systeem. Vervolgens wordt het recombinante eiwit gezuiverd uit
een homogenaat. Deze zuivering wordt gedaan door een kolom te gebruiken die
specifiek de tag bindt. Enkele veel gebruikte tags zijn:
, o His tag. Dit is een korte rij van minimaal 6 keer een histidine residu.
Hierdoor bindt dit stukje eiwit heel sterk aan nikkel of kobalt. Geëlueerd
wordt vervolgens met imidazool wat competeert voor binding met de
metaalionen.
o Glutathion-S-transferase (GST) tag. Dit is een relatief grote tag van 220
aminozuren. Het heeft een affiniteit voor glutathion. Je moet glutathione
eraf knippen, zodat je jouw intacte eiwit overhoudt. Eiwit blijft over in
zuivere en actieve vorm.
o Flag, HA en Myc tags. Dit zijn korte stukjes eiwit van ongeveer 10
aminozuren. Voor de binding van eiwitten met deze tags wordt gebruik
gemaakt van antilichamen die deze tags heel specifiek en sterk binden.
o Streptavidine. een van de sterkste niet-covalente interacties. Elutie
door overmaat biotine, waardoor antilichaam met eiwit loslaat.
Gelfiltratie: een kolom en met beads. Hierin passen bepaalde eiwitten.
Degene die er niet in passen gaan er langs en de andere gaan naar binnen.
Het gevolg is dat kleine eiwitten later van de kolom elueren dan grote
eiwitten. Bij Sephadex geeft de code achter de naam aan wat het
fractionerings-bereik is. Het fractioneringsgebied van Sephadex G-100 is
ongeveer van 4 kDa tot 150 kDa. Beads met grotere poriën zijn minder sterk en
worden vaak versterkt met bijvoorbeeld polyacrylamide.
Hiermee kun je rekenen: y = ax + b waarbij y de log is van het molecuul gewicht
en x is het elutie volume. Met twee waardes kun je a berekenen en daarmee b.
LES 2: SCHEIDING OP BASIS VAN POLARITEIT &
ELEKTROFORESE
Adsorptie chromatografie: scheiding op basis van verschil in polariteit tussen
stoffen. De stationaire fase is vast en polair en de mobiele fase is vloeibaar.
Polaire moleculen hebben meer affiniteit met de kolom. Apolaire moleculen gaan
snel door de kolom. Kan met kolom gedaan worden, of dunne laag
chromatografie.
Papier / dunne laag chromatografie: de mobiele fase trekt vanaf de bodem door
de stationaire fase en neemt de stoffen mee die gescheiden moeten worden.
Deze lopen elk tot een bepaald punt. De stationaire fase is een dunne laag
absorberend materiaal en is vaak polair. De mobiele fase beweegt over de
stationaire fase door capillaire werking en is vaak apolair. Detectie: aankleuren /
UV / radioactief. TLC (thin layer chrom) is snel en goedkoop. Als je geen
referentiestoffen hebt (uit tabel), kan je de Rf (loopafstand) bepalen. Deze
eigenschap is afhankelijk van de stof en op te zoeken. Ook kun je een onbekende
monster vergelijken met een referentiemonster.
afstand afgelegd door stof afstand afgelegd door stof
R F= R x=
afstand afgelegd door oplosmiddel afstand afgelegd door referentie
LES 1: BASISBEGRIPPEN VOOR
SCHEIDINGSMETHODEN, GELFILTRATIE EN
AFFINITEITSCHROMATOGRAFIE
Chromatografie: affiniteit voor mobiele of stationaire fase. Bij chromatografie heb
je een stationaire fase (vast of vloeibaar) en een mobiele fase (deze loopt langs
de stationaire fase, vloeibaar of gas). Stoffen met een hoge affiniteit (die dus wel
goed binden) voor de stationaire fase komen vertraagd van de kolom.
Preparatieve chromatografie: zuivering waarbij het product intact blijft.
Analytische chromatografie: zuivering waarbij hoeft het product niet intact hoeft
te blijven.
Kolomchromatografie heeft een glazen kolom. Bij de
computer komt er een chromatogram uit. Hierbij heb je de
hoogte, breedte en de retentietijd die van belang zijn. De
dode tijd (t0) is de tijd die nodig is voor de mobiele fase om
de kolom te verlaten. De retentietijd is de tijd tussen
injecteren van het monster en het midden van de piek van
het eluaat (dat wat van de kolom af komt). Bruto retentie tijd
is met dode tijd en de netto retentie tijd is zonder de dode tijd. De oppervlakte in
onder een piek zegt iets over hoeveel stof er aanwezig is. Hiermee kun je
rekenen:
1. De selectiviteit, het verschil in retentietijd:
α = (tb – t0) / (ta – t0)
2. De resolutie, de verhouding tussen de breedte van de kolom en de tijd
R = 2(ta – tb) / (Wa + Wb)
3. Efficiëntie, maat voor aantal pieken dat naast elkaar van je kolom af kan
komen = schotelgetal. Hoe hoger, hoe beter de scheiding. Dit kun je
verhogen door de lengte van de kolom te verlengen, de kwaliteit van
kolom materiaal te verbeteren, kleinere deeltjes te gebruiken en te zorgen
voor constante doorloopsnelheid.
Diffusie: bredere banden breder en mindere scheiding. Bij hogere elutiesnelheid
is er minder diffusie en dus betere scheiding. Daarom worden vaak hogedruk
pompen gebruikt:
o HPLC (high-performance liquid chromatography)
De eluens (loopvloeistof) kun je isocratisch (de mobiele fase heeft dan een
constante concentratie) en gradiënt (de mobiele fase heeft dan een
variërende concentratie) er
doorheen pompen. De
, detectors meten vervolgens of er stofjes langskomen. Dit is onder hoge
druk en voor kleine biologische moleculen.
o FPLC (fast protein liquid chromatography)
Dit is onder lagere druk, omdat het voor grotere moleculen is, zoals
eiwitten, die anders denatureren.
Gaschromatografie: de mobiele fase is een gas. De stationaire fase is een
vloeistof. Je hebt ook hier een druk regulator, detector een computer. De kolom
hiervan is vaak langer.
Affiniteitschromatografie: scheiding op basis van biospecificiteit, sleutel-slot-
principe. Als een mix van eiwitten wordt opgebracht, bindt alleen het eiwit dat
specifieke affiniteit heeft met de ligand. De overige eiwitten zullen niet binden en
worden weggewassen met de buffer. Vervolgens ga je
de kolom elueren. We onderscheiden 4 methodes
daarvoor:
1. Verandering van condities zoals pH en
zoutconcentratie.
2. Eiwit denaturatie.
3. Competitie met het eiwit voor binding op de
kolom.
4. Competitie voor binding aan het eiwit.
Affiniteitschromatografie met behulp van antilichamen
Op een kolom waar een eiwit aan is gebonden die sterk antilichamen kan binden,
wordt een antilichaam (eiwit dat specifiek aan een andere stof kan binden)
gebracht tegen het eiwit dat gezuiverd moet worden. Het te zuiveren eiwit wordt
gebonden door het antilichaam en de andere eiwitten worden van de kolom
gewassen. Geëlueerd kan worden door de pH kort te verlagen wat leidt tot het
verbreken van de antigeen-antilichaam binding.
Affiniteitschromatografie met behulp van “eiwit-tags”
Op DNA-niveau kan er een stukje DNA worden toegevoegd coderend (tag) voor
een eiwit wat men wil zuiveren. Het eiwit wordt vervolgens tot expressie
gebracht in een systeem. Vervolgens wordt het recombinante eiwit gezuiverd uit
een homogenaat. Deze zuivering wordt gedaan door een kolom te gebruiken die
specifiek de tag bindt. Enkele veel gebruikte tags zijn:
, o His tag. Dit is een korte rij van minimaal 6 keer een histidine residu.
Hierdoor bindt dit stukje eiwit heel sterk aan nikkel of kobalt. Geëlueerd
wordt vervolgens met imidazool wat competeert voor binding met de
metaalionen.
o Glutathion-S-transferase (GST) tag. Dit is een relatief grote tag van 220
aminozuren. Het heeft een affiniteit voor glutathion. Je moet glutathione
eraf knippen, zodat je jouw intacte eiwit overhoudt. Eiwit blijft over in
zuivere en actieve vorm.
o Flag, HA en Myc tags. Dit zijn korte stukjes eiwit van ongeveer 10
aminozuren. Voor de binding van eiwitten met deze tags wordt gebruik
gemaakt van antilichamen die deze tags heel specifiek en sterk binden.
o Streptavidine. een van de sterkste niet-covalente interacties. Elutie
door overmaat biotine, waardoor antilichaam met eiwit loslaat.
Gelfiltratie: een kolom en met beads. Hierin passen bepaalde eiwitten.
Degene die er niet in passen gaan er langs en de andere gaan naar binnen.
Het gevolg is dat kleine eiwitten later van de kolom elueren dan grote
eiwitten. Bij Sephadex geeft de code achter de naam aan wat het
fractionerings-bereik is. Het fractioneringsgebied van Sephadex G-100 is
ongeveer van 4 kDa tot 150 kDa. Beads met grotere poriën zijn minder sterk en
worden vaak versterkt met bijvoorbeeld polyacrylamide.
Hiermee kun je rekenen: y = ax + b waarbij y de log is van het molecuul gewicht
en x is het elutie volume. Met twee waardes kun je a berekenen en daarmee b.
LES 2: SCHEIDING OP BASIS VAN POLARITEIT &
ELEKTROFORESE
Adsorptie chromatografie: scheiding op basis van verschil in polariteit tussen
stoffen. De stationaire fase is vast en polair en de mobiele fase is vloeibaar.
Polaire moleculen hebben meer affiniteit met de kolom. Apolaire moleculen gaan
snel door de kolom. Kan met kolom gedaan worden, of dunne laag
chromatografie.
Papier / dunne laag chromatografie: de mobiele fase trekt vanaf de bodem door
de stationaire fase en neemt de stoffen mee die gescheiden moeten worden.
Deze lopen elk tot een bepaald punt. De stationaire fase is een dunne laag
absorberend materiaal en is vaak polair. De mobiele fase beweegt over de
stationaire fase door capillaire werking en is vaak apolair. Detectie: aankleuren /
UV / radioactief. TLC (thin layer chrom) is snel en goedkoop. Als je geen
referentiestoffen hebt (uit tabel), kan je de Rf (loopafstand) bepalen. Deze
eigenschap is afhankelijk van de stof en op te zoeken. Ook kun je een onbekende
monster vergelijken met een referentiemonster.
afstand afgelegd door stof afstand afgelegd door stof
R F= R x=
afstand afgelegd door oplosmiddel afstand afgelegd door referentie
