Moleculaire diagnostiek
Les 1
-Moleculaire diagnostieken:
>Analyseren moleculen DNA/RNA/eiwitten en/of antilichamen
>Pathogenen
>Afwijkingen in genetisch materiaal
-Introductie moleculaire diagnostieken:
>
-Isolatie pathogeen:
>Microscopie
>Cultuur
>Voordelen en nadelen
-Antigeen/antilichaam detectie:
>Serologie/immunologie
>Antigeen-antilichaam
>Interferon-y
>Voordelen/nadelen
-Eiwit detectie:
>MALDI-TOF
>Voordelen/nadelen
-Genoom detectie:
>PCR
>RRT-PCR
>Voordelen/nadelen
-Diagnostische testen:
>Belangrijke aspecten:
*Specificiteit (specifiek zijn voor wat je wilt aantonen)
*Gevoeligheid
*Looptijd (niet te lang duren)
*Training van personeel (niet te moeilijk qua training)
*Apparatuur/lab (wel of niet op het lab)
*Kosten
*Betrouwbaarheid
-Nucleïnezuuranalyse:
>Nucleïnezuur isolatie (en daarna vermeerderen)
>PCR, sequencing
>RNA -> omkeerbare transcriptase
>Geautomatiseerde NA isolatie
*Voorbeeld: Roche MagnaPure
Made by: Iris Gülcher
, >UV-spectrometrie:
*Kwantiteit en kwaliteit
>Gelelektroforese
>Amplificatie: PCR, sequencing (wordt het meeste gebruikt)
-PCR amplificatie:
>Conventioneel vs real-time PCR:
*Kwalitatief (semi-kwantitatief) (niet precieze hoeveelheid) // kwantitatief (precieze
hoeveelheid)
*Eindfasedetectie (je meet op het einde) // detectie exponentiële fase (je meet
voortdurend)
*Open systeem (veel contaminatie) // gesloten systeem (min mogelijk contaminatie
krijgen van het vermeerderde product)
*Minder gevoelig // gevoelig
*Goedkoop // duur
> *Conventioneel op het einde
op de gel zetten
*Als iets eerder opkomt in
expotentiële fase kun je
kwantificeren (omdat er
meer in je product zat))
*Cicle of Quantification (CQ)
treshold (hoe lager CQ hoe
meer je van product hebt)
-Analyse van amplificatie:
>Fluorescentie (het meten van de samples):
*Sybr Green: bindt dsDNA
*Probes: doelspecifieke binding (hybridisatie) (3de stukje nucleïnezuur dat in de
sequentie schuift)
-Sybr Green smeltcurve analyse:
>Doel en andere dsDNA:
*Primer-dimer
*Aspecifieke producten
*Amplificatie afgerond heb je bepaalde hoeveelheid fluorescentie, al het dsDNA ga je
verwarmen (uitsmelten) bepaalde temperatuur gaan de strengen uit elkaar
(enkelstrengs DNA wordt gevormd), fluorescentie signaal zakt en als alles
enkelstrengs is heb je geen fluorescentie meer (50% fluorescentie over =
smelttemperatuur)
Made by: Iris Gülcher
Les 1
-Moleculaire diagnostieken:
>Analyseren moleculen DNA/RNA/eiwitten en/of antilichamen
>Pathogenen
>Afwijkingen in genetisch materiaal
-Introductie moleculaire diagnostieken:
>
-Isolatie pathogeen:
>Microscopie
>Cultuur
>Voordelen en nadelen
-Antigeen/antilichaam detectie:
>Serologie/immunologie
>Antigeen-antilichaam
>Interferon-y
>Voordelen/nadelen
-Eiwit detectie:
>MALDI-TOF
>Voordelen/nadelen
-Genoom detectie:
>PCR
>RRT-PCR
>Voordelen/nadelen
-Diagnostische testen:
>Belangrijke aspecten:
*Specificiteit (specifiek zijn voor wat je wilt aantonen)
*Gevoeligheid
*Looptijd (niet te lang duren)
*Training van personeel (niet te moeilijk qua training)
*Apparatuur/lab (wel of niet op het lab)
*Kosten
*Betrouwbaarheid
-Nucleïnezuuranalyse:
>Nucleïnezuur isolatie (en daarna vermeerderen)
>PCR, sequencing
>RNA -> omkeerbare transcriptase
>Geautomatiseerde NA isolatie
*Voorbeeld: Roche MagnaPure
Made by: Iris Gülcher
, >UV-spectrometrie:
*Kwantiteit en kwaliteit
>Gelelektroforese
>Amplificatie: PCR, sequencing (wordt het meeste gebruikt)
-PCR amplificatie:
>Conventioneel vs real-time PCR:
*Kwalitatief (semi-kwantitatief) (niet precieze hoeveelheid) // kwantitatief (precieze
hoeveelheid)
*Eindfasedetectie (je meet op het einde) // detectie exponentiële fase (je meet
voortdurend)
*Open systeem (veel contaminatie) // gesloten systeem (min mogelijk contaminatie
krijgen van het vermeerderde product)
*Minder gevoelig // gevoelig
*Goedkoop // duur
> *Conventioneel op het einde
op de gel zetten
*Als iets eerder opkomt in
expotentiële fase kun je
kwantificeren (omdat er
meer in je product zat))
*Cicle of Quantification (CQ)
treshold (hoe lager CQ hoe
meer je van product hebt)
-Analyse van amplificatie:
>Fluorescentie (het meten van de samples):
*Sybr Green: bindt dsDNA
*Probes: doelspecifieke binding (hybridisatie) (3de stukje nucleïnezuur dat in de
sequentie schuift)
-Sybr Green smeltcurve analyse:
>Doel en andere dsDNA:
*Primer-dimer
*Aspecifieke producten
*Amplificatie afgerond heb je bepaalde hoeveelheid fluorescentie, al het dsDNA ga je
verwarmen (uitsmelten) bepaalde temperatuur gaan de strengen uit elkaar
(enkelstrengs DNA wordt gevormd), fluorescentie signaal zakt en als alles
enkelstrengs is heb je geen fluorescentie meer (50% fluorescentie over =
smelttemperatuur)
Made by: Iris Gülcher
