BMW Pathologie Hoorcolleges
Inhoud
Hoorcollege 1 – Onderzoeksmethoden................................................................................................... 2
Hoorcollege 2 – Celpathologie: Adaptatie, schade en celdood .............................................................. 7
Hoorcollege 3 – Tumoren I .................................................................................................................... 14
Hoorcollege 4 – Tumoren II ................................................................................................................... 18
Hoorcollege 5 – Tumoren III .................................................................................................................. 23
Hoorcollege 6 – Tumorpathologie......................................................................................................... 28
1
,Hoorcollege 1 – Onderzoeksmethoden
Oefenvraag 9:
•
Medulloblastomen zijn dus niet in staat om T-cellen af te remmen. Immunotherapie heeft geen
zin want er zit geen PD1 op
• Immunohistochemie = aankleuren van bepaalde eiwitten in weefsels met antilichamen
• Voordeel 1: je kan de locatie van eiwitten aantonen. Goedkoop, je kan het binnen een dag doen
• Voordeel 2: je kan niks zeggen over absolute hoeveelheid maar binnen een kleuring kan je kijken
welke cellen meer tot expressie komen tot andere. Maar dit mag niet vergeleken worden met
andere kleuringen, want deze antilichamen kunnen andere affiniteit hebben. Dus mag alleen bij
dezelfde kleuring
• Nadeel 1: je kan niet kwantificeren, kan wel met qPCR. Dan kijk je naar hoeveelheid RNA expressie
van je specifieke gen dat je wilt bekijken. Dit haal je uit cellen. Het is semi-kwantitatief.
• Nadeel 2:
• ELISA is wel kwantitatief
• Je kan weefsel losmaken, cellen dissociëren en een FACS doen. Je kan dan precies zien welke
cellen er zijn.
• Westernblot en qPCR is fout want dan weet je niet dat het tumor-geassocieerd is. tenzij je zegt dat
je alleen kankercellen pakt en die gaat bekijken. Dus goed beargumenteren
• Epitoop van antistof die wordt gebruikt wordt gemaskeerd, dus er zit een eiwit in de weg, maar
het eiwit zit er wel.
2
,• Je gaat een knockout maken van PA-2017. Je gaat de killing van de tumorcellen door de T-cellen
meten. Tumorcelkweek met T-cellen en readout is tumor cell killing. Daarna knock je uit en check
je wat er gebeurt is met de readout. Dat bepaald hoe belangrijk de cel is
• Knockout maken doe je door CRISPR-CAS
• Je kan ook belang van het eiwit testen door overexpressie. Dan krijg je het omgekeerde fenotype
en dan kan je kijken hoe belangrijk het is. dit doe je door dupliceren van het gen met CRISPR of
plasmiden gebruiken na kloneren van het gen. Dus zorgen dat de promotor aangezet wordt.
• Dus blokkeert de rem. Dus daardoor is het gunstig. Je kan de cellen kweken maar je weet niet hoe
groot de expressie is. bacteriën en gisten kunnen niet goed glycolyseren, deze zijn dus niet
geschikt en dan kan je dus beter een eukaryoot systeem pakken, ondanks dat de expressie minder
hoog is
• Als je eiwit wilt blokkeren, dan gebruik je een specifieke inhibitor. Of een receptor/antilichamen
die een hele hoge affiniteit hiervoor heeft zodat het wordt geblokkeerd door de binding hiermee.
Deze stoffen maak je vaak middels geiten of andere dieren. Je moet dan eerst het eiwit zuiveren,
en daarna in het dier spuiten. Muis is het beste want kan je makkelijk kweken en je kan
monoklonale antistoffen maken met een muis. Bij andere dieren is het polyklonaal
Hiertegen worden antistoffen gemaakt en deze ga je isoleren. Je mimickt dus de bindingsplaats.
Deze kan je dus als competiter toevoegen.
Oefenvraag 10
3
, • Cl- transport vindt niet meer goed plaats, daardoor heb je overmatig slijm
1. Je gaat de mutatie inbrengen in de stamcellen met CRISPR-CAS, pas dan kan je de mutant
vergelijken met het wildtype (dit is de controle). Je hebt ook een functionele readout nodig. Dat is
hier de chloortransport. Dan kan je de mutant en wildtype met elkaar vergelijken.
Alternatief mutant eiwit bestuderen: het gen inbrengen in een plasmide en vervolgens in de cellen
brengen. Je moet dan dezelfde cellijn hebben met een wildtype en een mutant, deze ga je dan
met elkaar vergelijken
2. Pull-down essay. Je gebruikt een techniek waarbij je kijkt welke eiwitten blijven zitten aan je eiwit.
Er wordt een membraan gebruikt en daaraan doe je je target eiwit (gemuteerde CFTR eiwit). Dan
voeg je je medium toe, incl targeteiwit die eraan zou kunnen binden (PATHO2021). Dan ga je
wassen en ga je kijken welke eiwitten aan elkaar hebben gebonden. De controle is je wildtype.
Dan kijken welk eiwit (PATHO2021) bindt aan wildtype (niet) en aan mutant (wel).
massaspectometrie → om te kijken om welk eiwit het gaat. Je doet je eiwit in een machine en je
kijkt naar de time of flight van het eiwit
3. Maken van knockout muis met PATHO2021, voorwaarde is dan wel een mutatie moet inbrengen
in het Cl-kanaal. Je neem dan een slijmvorming of CF readout. Een reporter is het inbrengen van
een ander eiwit in een bv darmcel, dit is een sensor. Wordt bv groen als het veel is en rood als het
weinig is.
Andere manier is overexpressie induceren. Kan je doen met een plasmide, maar dit moet je
constant weer inspuiten. Je kan ook een virale promotor gebruiken, dit is een promotor die altijd
zorgt voor het afschrijven van genen.
4. Je kan een peptide laten binden aan het mutante kanaal, ipv PATHO2021. Er is dan competie
waardoor PATHO2021 niet kan binden. Zo’n peptide ga je ontwikkelen door het weten van de
sequentie van de bindingszijde. Deze zijde bepaal je door het bekijken van het complex middels
eiwitkristalisatie. Eiwit-eiwit interactie gaat middels best wat peptiden, niet alleen ééntje. Kan via
hele verschillende plekken zijn in de sequentie, maar in de vouwing komt dat bij elkaar (met je
hand een tennisbal vangen).
Je kan ook een peptide maken uit CFTR en dan competeer je PATHO2021 weg en dan blijft het
kanaal nog gewoon intact.
Deze technieken moet je dan in vitro gaan testen.
Je kan ook antilichamen gebruiken tegen PATHO2021. Deze antistof moet dan gericht zijn tegen
het Cl-kanaal, maar het moet niet het kanaal blokkeren maar de bindingsplek. Maar je kan de
antistof ook tegen PATHO richten, dan laat je het CL kanaal met rust. Maar dan hoop je op niet te
veel bijwerkingen.
Cl kanaal is veel kleiner dan een antistof.
4
Inhoud
Hoorcollege 1 – Onderzoeksmethoden................................................................................................... 2
Hoorcollege 2 – Celpathologie: Adaptatie, schade en celdood .............................................................. 7
Hoorcollege 3 – Tumoren I .................................................................................................................... 14
Hoorcollege 4 – Tumoren II ................................................................................................................... 18
Hoorcollege 5 – Tumoren III .................................................................................................................. 23
Hoorcollege 6 – Tumorpathologie......................................................................................................... 28
1
,Hoorcollege 1 – Onderzoeksmethoden
Oefenvraag 9:
•
Medulloblastomen zijn dus niet in staat om T-cellen af te remmen. Immunotherapie heeft geen
zin want er zit geen PD1 op
• Immunohistochemie = aankleuren van bepaalde eiwitten in weefsels met antilichamen
• Voordeel 1: je kan de locatie van eiwitten aantonen. Goedkoop, je kan het binnen een dag doen
• Voordeel 2: je kan niks zeggen over absolute hoeveelheid maar binnen een kleuring kan je kijken
welke cellen meer tot expressie komen tot andere. Maar dit mag niet vergeleken worden met
andere kleuringen, want deze antilichamen kunnen andere affiniteit hebben. Dus mag alleen bij
dezelfde kleuring
• Nadeel 1: je kan niet kwantificeren, kan wel met qPCR. Dan kijk je naar hoeveelheid RNA expressie
van je specifieke gen dat je wilt bekijken. Dit haal je uit cellen. Het is semi-kwantitatief.
• Nadeel 2:
• ELISA is wel kwantitatief
• Je kan weefsel losmaken, cellen dissociëren en een FACS doen. Je kan dan precies zien welke
cellen er zijn.
• Westernblot en qPCR is fout want dan weet je niet dat het tumor-geassocieerd is. tenzij je zegt dat
je alleen kankercellen pakt en die gaat bekijken. Dus goed beargumenteren
• Epitoop van antistof die wordt gebruikt wordt gemaskeerd, dus er zit een eiwit in de weg, maar
het eiwit zit er wel.
2
,• Je gaat een knockout maken van PA-2017. Je gaat de killing van de tumorcellen door de T-cellen
meten. Tumorcelkweek met T-cellen en readout is tumor cell killing. Daarna knock je uit en check
je wat er gebeurt is met de readout. Dat bepaald hoe belangrijk de cel is
• Knockout maken doe je door CRISPR-CAS
• Je kan ook belang van het eiwit testen door overexpressie. Dan krijg je het omgekeerde fenotype
en dan kan je kijken hoe belangrijk het is. dit doe je door dupliceren van het gen met CRISPR of
plasmiden gebruiken na kloneren van het gen. Dus zorgen dat de promotor aangezet wordt.
• Dus blokkeert de rem. Dus daardoor is het gunstig. Je kan de cellen kweken maar je weet niet hoe
groot de expressie is. bacteriën en gisten kunnen niet goed glycolyseren, deze zijn dus niet
geschikt en dan kan je dus beter een eukaryoot systeem pakken, ondanks dat de expressie minder
hoog is
• Als je eiwit wilt blokkeren, dan gebruik je een specifieke inhibitor. Of een receptor/antilichamen
die een hele hoge affiniteit hiervoor heeft zodat het wordt geblokkeerd door de binding hiermee.
Deze stoffen maak je vaak middels geiten of andere dieren. Je moet dan eerst het eiwit zuiveren,
en daarna in het dier spuiten. Muis is het beste want kan je makkelijk kweken en je kan
monoklonale antistoffen maken met een muis. Bij andere dieren is het polyklonaal
Hiertegen worden antistoffen gemaakt en deze ga je isoleren. Je mimickt dus de bindingsplaats.
Deze kan je dus als competiter toevoegen.
Oefenvraag 10
3
, • Cl- transport vindt niet meer goed plaats, daardoor heb je overmatig slijm
1. Je gaat de mutatie inbrengen in de stamcellen met CRISPR-CAS, pas dan kan je de mutant
vergelijken met het wildtype (dit is de controle). Je hebt ook een functionele readout nodig. Dat is
hier de chloortransport. Dan kan je de mutant en wildtype met elkaar vergelijken.
Alternatief mutant eiwit bestuderen: het gen inbrengen in een plasmide en vervolgens in de cellen
brengen. Je moet dan dezelfde cellijn hebben met een wildtype en een mutant, deze ga je dan
met elkaar vergelijken
2. Pull-down essay. Je gebruikt een techniek waarbij je kijkt welke eiwitten blijven zitten aan je eiwit.
Er wordt een membraan gebruikt en daaraan doe je je target eiwit (gemuteerde CFTR eiwit). Dan
voeg je je medium toe, incl targeteiwit die eraan zou kunnen binden (PATHO2021). Dan ga je
wassen en ga je kijken welke eiwitten aan elkaar hebben gebonden. De controle is je wildtype.
Dan kijken welk eiwit (PATHO2021) bindt aan wildtype (niet) en aan mutant (wel).
massaspectometrie → om te kijken om welk eiwit het gaat. Je doet je eiwit in een machine en je
kijkt naar de time of flight van het eiwit
3. Maken van knockout muis met PATHO2021, voorwaarde is dan wel een mutatie moet inbrengen
in het Cl-kanaal. Je neem dan een slijmvorming of CF readout. Een reporter is het inbrengen van
een ander eiwit in een bv darmcel, dit is een sensor. Wordt bv groen als het veel is en rood als het
weinig is.
Andere manier is overexpressie induceren. Kan je doen met een plasmide, maar dit moet je
constant weer inspuiten. Je kan ook een virale promotor gebruiken, dit is een promotor die altijd
zorgt voor het afschrijven van genen.
4. Je kan een peptide laten binden aan het mutante kanaal, ipv PATHO2021. Er is dan competie
waardoor PATHO2021 niet kan binden. Zo’n peptide ga je ontwikkelen door het weten van de
sequentie van de bindingszijde. Deze zijde bepaal je door het bekijken van het complex middels
eiwitkristalisatie. Eiwit-eiwit interactie gaat middels best wat peptiden, niet alleen ééntje. Kan via
hele verschillende plekken zijn in de sequentie, maar in de vouwing komt dat bij elkaar (met je
hand een tennisbal vangen).
Je kan ook een peptide maken uit CFTR en dan competeer je PATHO2021 weg en dan blijft het
kanaal nog gewoon intact.
Deze technieken moet je dan in vitro gaan testen.
Je kan ook antilichamen gebruiken tegen PATHO2021. Deze antistof moet dan gericht zijn tegen
het Cl-kanaal, maar het moet niet het kanaal blokkeren maar de bindingsplek. Maar je kan de
antistof ook tegen PATHO richten, dan laat je het CL kanaal met rust. Maar dan hoop je op niet te
veel bijwerkingen.
Cl kanaal is veel kleiner dan een antistof.
4
