Recombinant DNA technology
Concepts of Genetics – Hoofdstuk 22
22.1
Recombinant DNA techniek kan plaatsvinden door restrictie enzymen en DNA
cloning vectors.
Restrictie enzymen zijn een bescherm mechanisme van bacteriën tegen infecties
door virussen. Binnenkomend viraal DNA wordt in stukjes geknipt, zodat het geen
schade aan de bacterie kan veroorzaken.
Restrictie site plaats waar restrictie enzymen gaan knippen. Dit is een plek op
het DNA met een specifieke nucleotiden sequentie.
Palindroom de nucleotide sequentie is hetzelfde op beide strengen van het
DNA als je in de 5’ naar 3’ richting leest. 5’ AAGCTT 3’ boven en onder 5’ AAGCTT
3’
Blunt ends zijn recht naar benden geknipt en hebben geen uitsteeksel. Deze
passen altijd op elkaar.
Cohesive ends hebben wel uitsteeksels en kunnen makkelijker geligeerd worden.
Stukjes DNA die door hetzelfde restrictie enzym zijn geknipt, kunnen aan elkaar
gaan zitten. DNA ligase herstelt de backbone.
Plasmide wordt ook wel vector genoemd stuk DNA dat iets op kan nemen en
naar een andere cel kan brengen.
- Een vector heeft meerdere restrictie sites, zodat er DNA fragmenten
kunnen worden ingevoegd die moeten worden gekloond.
- Vectoren moeten in gastheercellen worden ingebracht om onafhankelijke
replicatie van het vector DNA en elk DNA fragment dat het draagt te
krijgen.
- Vectoren moeten een selectable marker gene hebben (meestal een
antibiotica resistentie gen), zodat je onderscheid kunt maken tussen
gastheercellen die het DNA wel hebben opgenomen en gastheercellen die
dit niet hebben gedaan.
- Veel vectoren hebben specifieke sequenties zodat sequencing van het
nieuwe DNA mogelijk is.
- De vector en het ingebrachte DNA fragment moeten makkelijk te isoleren
zijn uit de gastheercel, zodat het gekloonde DNA elders gebruikt kan
worden.
Een plasmide is een extrachromosomaal dubbelstrengs DNA molecuul dat
onafhankelijk van chromosomen kan repliceren in bacteriële cellen.
Transformatie het overbrengen van plasmiden in bacteriën. Vaak worden er
maar één of een paar plasmiden overgebracht in een bacterie door middel van
transformatie.
Multiple cloning site plaats waar veel restrictie sites aanwezig zijn voor de
verschillende restrictie enzymen.
Aan de kleur van je kolonies kan je zien of er mogelijk recombinatie is
opgetreden.
Knippen met twee verschillende restrictie enzymen zorgt ervoor dat er geen
zelfsluiting plaats kan vinden.
Concepts of Genetics – Hoofdstuk 22
22.1
Recombinant DNA techniek kan plaatsvinden door restrictie enzymen en DNA
cloning vectors.
Restrictie enzymen zijn een bescherm mechanisme van bacteriën tegen infecties
door virussen. Binnenkomend viraal DNA wordt in stukjes geknipt, zodat het geen
schade aan de bacterie kan veroorzaken.
Restrictie site plaats waar restrictie enzymen gaan knippen. Dit is een plek op
het DNA met een specifieke nucleotiden sequentie.
Palindroom de nucleotide sequentie is hetzelfde op beide strengen van het
DNA als je in de 5’ naar 3’ richting leest. 5’ AAGCTT 3’ boven en onder 5’ AAGCTT
3’
Blunt ends zijn recht naar benden geknipt en hebben geen uitsteeksel. Deze
passen altijd op elkaar.
Cohesive ends hebben wel uitsteeksels en kunnen makkelijker geligeerd worden.
Stukjes DNA die door hetzelfde restrictie enzym zijn geknipt, kunnen aan elkaar
gaan zitten. DNA ligase herstelt de backbone.
Plasmide wordt ook wel vector genoemd stuk DNA dat iets op kan nemen en
naar een andere cel kan brengen.
- Een vector heeft meerdere restrictie sites, zodat er DNA fragmenten
kunnen worden ingevoegd die moeten worden gekloond.
- Vectoren moeten in gastheercellen worden ingebracht om onafhankelijke
replicatie van het vector DNA en elk DNA fragment dat het draagt te
krijgen.
- Vectoren moeten een selectable marker gene hebben (meestal een
antibiotica resistentie gen), zodat je onderscheid kunt maken tussen
gastheercellen die het DNA wel hebben opgenomen en gastheercellen die
dit niet hebben gedaan.
- Veel vectoren hebben specifieke sequenties zodat sequencing van het
nieuwe DNA mogelijk is.
- De vector en het ingebrachte DNA fragment moeten makkelijk te isoleren
zijn uit de gastheercel, zodat het gekloonde DNA elders gebruikt kan
worden.
Een plasmide is een extrachromosomaal dubbelstrengs DNA molecuul dat
onafhankelijk van chromosomen kan repliceren in bacteriële cellen.
Transformatie het overbrengen van plasmiden in bacteriën. Vaak worden er
maar één of een paar plasmiden overgebracht in een bacterie door middel van
transformatie.
Multiple cloning site plaats waar veel restrictie sites aanwezig zijn voor de
verschillende restrictie enzymen.
Aan de kleur van je kolonies kan je zien of er mogelijk recombinatie is
opgetreden.
Knippen met twee verschillende restrictie enzymen zorgt ervoor dat er geen
zelfsluiting plaats kan vinden.
