Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
Moleculaire celbiologie
1 – Technologie update
Ia – genetische manipulatie van dierencellen en
modelorganismen
Introductie van nucleïnezuren in eukaryote cellen
Basis van de moderne biotechnologie - overbrugt alle soortenbarrières
(<-> genetische manipulatie door kruising)
Transfection: proces waarbij nucleïnezuren (DNA/RNA) of macromoleculen in dierlijke cellen worden
geïntroduceerd via chemische, fysische of mechanische methoden.
Wanneer een fenotype hierbij wordt gewijzigd, wordt dit transformatie genoemd (bv morfologische
transformatie, groeitransformatie).
DNA introductie in micro-organismen wordt ook wel transformatie genoemd.
Transductie: Wanneer een virus wordt gebruikt voor de introductie van nucleïnezuren (DNA/RNA) of
macromoleculen.
Belangrijk verschil van waar je plasmide of RNA inbrengt ->
bv in nucleus of cytoplasma
Resultaat van een transfectie/transductie = transfectant
Stabiele transfectant – nucleïnezuren worden geïntegreerd in het genoom
Transiënte transfectant – geen integratie van nucleïnezuren en dus slechts tijdelijk
Stable transfection: 1 kopie komt in genoom -> transcriptie en translatie komt van 1 kopie
cel beetje forceren (duurt enkele weken) -> meer tijd nodig
je kan de cel bevriezen en dan analyseren
transient transfection: high copy number -> hogere expressie
,Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
Toepassingen van transfectie/transductie:
Functioneel onderzoek: studie van eiwitfunctie, lokalisatie, interacties,...; overexpressie of
knockdown (silencing) mogelijk
Gentherapie: directe delivery of via bv embryonale stamcellen – vervangen van een gemuteerd gen,
inactivatie van een gemuteerd gen, introductie van een nieuw gen.
gentherapie: vaak vanaf de lever -> makkelijkst om te bereiken, alles wordt gekuist door de lever
cell base delivery: cellen uit lichaam manipuleren en dan weer in de patiënt steken, moeilijk omdat
men niet weet of het weer op de juiste plaats gaat terugkomen en of het gaat overleven.
Moeilijk om DNA binnen te brengen: DNA en membranen zijn negatief geladen
DNA moet door celmembraan en nucleair membraan
RNA is voldoende om in cytoplasma te geraken
Cel: 10-15 micrometer
,Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
constitutieve expressie (continu expressie) <-> induceerbare expressie (expressie na prikkel)
exogeen -> wat je zelf toegevoegd hebt <-> endogeen -> wat er al is
exogeen gedraagt zich vaak hetzelfde als endogeen
Niet virale methoden – mechanisch: micro injectie
• In cytoplasma of nucleus (veel expertise nodig + veel tijd)
• Volume tot 10fl (ook mogelijk met grotere volumes in bijvoorbeeld Xenopus-eicellen)
• Tot 100% efficiëntie, maar zeer arbeidsintensief en dus beperkt tot maximaal 1000 cellen per
experiment, en vaak minder.
Primaire cel = cel afgeleid van het weefsel -> zijn al gedifferentieerd en gaan niet meer delen.
Daarom wordt er vaak gebruik gemaakt van kanker cellen -> onsterfelijk en blijven delen
Delende cellen zijn makkelijker voor transient transfectie -> barriere makkelijker te bereiken?
Omgeving nodig voor een cel : lichaamstemperatuur, gebufferd medium, rijk medium, goed lever van
CO2 (5%), vochtigheid.
voordelen nadelen
Relatief hoge stabiele integratie van DNA in Duur apparaat
vergelijking met andere methoden
Effectieve methode voor de transfectie van Het aantal te transfecteren cellen is beperkt
primaire cellen
Geïnjecteerd DNA wordt niet onderworpen aan Opgeleid personeel is noodzakelijk
wijzigingen
Techniek die vaak wordt gebruikt om DNA in Niet geschikt voor alle celtypen (noodzaak voor
embryonale stamcellen te introduceren voor grote cellen)
het genereren van transgene
organismen
, Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
Niet virale methoden – mechanisch: microprojectile - bombardment
Voornamelijk gebruikt voor de introductie van DNA in totale organismen (plant of dier) of organen.
Kleine deeltjes (Ø van 1 micrometer) van bijvoorbeeld goud wordt gecoat met DNA en vervolgens
letterlijk op het doel geschoten met bijvoorbeeld heliumdruk.
voordelen nadelen
Eenvoudige snelle techniek Lagere transfectie-efficiëntie in vergelijking met
bv elektroporatie, virale transductie of
lipofection.
Celtype onafhankelijk Vereist de creatie microdeeltjes
Slechts een beperkte hoeveelheid DNA nodig Duur apparaat
Levering van grote DNA fragmenten is mogelijk Kan fysieke schade veroorzaken en dus veel
celdood.
Vereist weinig manipulatie van de cellen
Hoge reproduceerbaarheid
Niet virale methoden – fysisch: elektroporatie
Tijdelijke perforatie van het plasmamembraan door het veroorzaken van een elektrisch veld in het
medium.
• Elektrisch veld met hoge intensiteit die tijdelijk het membraan destabiliseert.
• Membraan wordt daardoor doorlaatbaar voor exogene moleculen aanwezig in het medium
• DNA/RNA kan de cel doordringen doorheen de poriën aanwezig in het membraan.
• Bij verwijdering van het elektrisch veld zullen de membraanporiën hersluiten, een deel van
het DNA/RNA is geïnternaliseerd.
voordelen nadelen
Snel Lage transfectie-efficiëntie, vooral in primaire
cellen
Goedkoop Optimalisatie nodig per celtype
Eenvoudige uitvoering Hoge toxiciteit als gevolg van hoge elektrische
pulsen of als gevolg van slechts gedeeltelijke
terugwinning van het membraan.
Hoog aantal cellen/tijd
Relatief hoge kansen voor stabiele
transformanten
Het aantal genkopieën per cel is meestal
beperkt tot 1
Toepasbaar op veel celtypen
Moleculaire celbiologie
1 – Technologie update
Ia – genetische manipulatie van dierencellen en
modelorganismen
Introductie van nucleïnezuren in eukaryote cellen
Basis van de moderne biotechnologie - overbrugt alle soortenbarrières
(<-> genetische manipulatie door kruising)
Transfection: proces waarbij nucleïnezuren (DNA/RNA) of macromoleculen in dierlijke cellen worden
geïntroduceerd via chemische, fysische of mechanische methoden.
Wanneer een fenotype hierbij wordt gewijzigd, wordt dit transformatie genoemd (bv morfologische
transformatie, groeitransformatie).
DNA introductie in micro-organismen wordt ook wel transformatie genoemd.
Transductie: Wanneer een virus wordt gebruikt voor de introductie van nucleïnezuren (DNA/RNA) of
macromoleculen.
Belangrijk verschil van waar je plasmide of RNA inbrengt ->
bv in nucleus of cytoplasma
Resultaat van een transfectie/transductie = transfectant
Stabiele transfectant – nucleïnezuren worden geïntegreerd in het genoom
Transiënte transfectant – geen integratie van nucleïnezuren en dus slechts tijdelijk
Stable transfection: 1 kopie komt in genoom -> transcriptie en translatie komt van 1 kopie
cel beetje forceren (duurt enkele weken) -> meer tijd nodig
je kan de cel bevriezen en dan analyseren
transient transfection: high copy number -> hogere expressie
,Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
Toepassingen van transfectie/transductie:
Functioneel onderzoek: studie van eiwitfunctie, lokalisatie, interacties,...; overexpressie of
knockdown (silencing) mogelijk
Gentherapie: directe delivery of via bv embryonale stamcellen – vervangen van een gemuteerd gen,
inactivatie van een gemuteerd gen, introductie van een nieuw gen.
gentherapie: vaak vanaf de lever -> makkelijkst om te bereiken, alles wordt gekuist door de lever
cell base delivery: cellen uit lichaam manipuleren en dan weer in de patiënt steken, moeilijk omdat
men niet weet of het weer op de juiste plaats gaat terugkomen en of het gaat overleven.
Moeilijk om DNA binnen te brengen: DNA en membranen zijn negatief geladen
DNA moet door celmembraan en nucleair membraan
RNA is voldoende om in cytoplasma te geraken
Cel: 10-15 micrometer
,Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
constitutieve expressie (continu expressie) <-> induceerbare expressie (expressie na prikkel)
exogeen -> wat je zelf toegevoegd hebt <-> endogeen -> wat er al is
exogeen gedraagt zich vaak hetzelfde als endogeen
Niet virale methoden – mechanisch: micro injectie
• In cytoplasma of nucleus (veel expertise nodig + veel tijd)
• Volume tot 10fl (ook mogelijk met grotere volumes in bijvoorbeeld Xenopus-eicellen)
• Tot 100% efficiëntie, maar zeer arbeidsintensief en dus beperkt tot maximaal 1000 cellen per
experiment, en vaak minder.
Primaire cel = cel afgeleid van het weefsel -> zijn al gedifferentieerd en gaan niet meer delen.
Daarom wordt er vaak gebruik gemaakt van kanker cellen -> onsterfelijk en blijven delen
Delende cellen zijn makkelijker voor transient transfectie -> barriere makkelijker te bereiken?
Omgeving nodig voor een cel : lichaamstemperatuur, gebufferd medium, rijk medium, goed lever van
CO2 (5%), vochtigheid.
voordelen nadelen
Relatief hoge stabiele integratie van DNA in Duur apparaat
vergelijking met andere methoden
Effectieve methode voor de transfectie van Het aantal te transfecteren cellen is beperkt
primaire cellen
Geïnjecteerd DNA wordt niet onderworpen aan Opgeleid personeel is noodzakelijk
wijzigingen
Techniek die vaak wordt gebruikt om DNA in Niet geschikt voor alle celtypen (noodzaak voor
embryonale stamcellen te introduceren voor grote cellen)
het genereren van transgene
organismen
, Examen -> show what you know, gedetailleerd !!
Niet virale methoden – mechanisch: microprojectile - bombardment
Voornamelijk gebruikt voor de introductie van DNA in totale organismen (plant of dier) of organen.
Kleine deeltjes (Ø van 1 micrometer) van bijvoorbeeld goud wordt gecoat met DNA en vervolgens
letterlijk op het doel geschoten met bijvoorbeeld heliumdruk.
voordelen nadelen
Eenvoudige snelle techniek Lagere transfectie-efficiëntie in vergelijking met
bv elektroporatie, virale transductie of
lipofection.
Celtype onafhankelijk Vereist de creatie microdeeltjes
Slechts een beperkte hoeveelheid DNA nodig Duur apparaat
Levering van grote DNA fragmenten is mogelijk Kan fysieke schade veroorzaken en dus veel
celdood.
Vereist weinig manipulatie van de cellen
Hoge reproduceerbaarheid
Niet virale methoden – fysisch: elektroporatie
Tijdelijke perforatie van het plasmamembraan door het veroorzaken van een elektrisch veld in het
medium.
• Elektrisch veld met hoge intensiteit die tijdelijk het membraan destabiliseert.
• Membraan wordt daardoor doorlaatbaar voor exogene moleculen aanwezig in het medium
• DNA/RNA kan de cel doordringen doorheen de poriën aanwezig in het membraan.
• Bij verwijdering van het elektrisch veld zullen de membraanporiën hersluiten, een deel van
het DNA/RNA is geïnternaliseerd.
voordelen nadelen
Snel Lage transfectie-efficiëntie, vooral in primaire
cellen
Goedkoop Optimalisatie nodig per celtype
Eenvoudige uitvoering Hoge toxiciteit als gevolg van hoge elektrische
pulsen of als gevolg van slechts gedeeltelijke
terugwinning van het membraan.
Hoog aantal cellen/tijd
Relatief hoge kansen voor stabiele
transformanten
Het aantal genkopieën per cel is meestal
beperkt tot 1
Toepasbaar op veel celtypen
