PROTEOMICS
Samenvatting Garry Corthals
Waarom eiwitten bestuderen?
- Grote moleculen die bijna alle functies in het lichaam uitvoeren > structuur, signalering,
katalyse, immuniteit (antilichamen), regulatie, transport
- Eiwit dysfunctie is belangrijke oorzaak van ziekte
- De meeste drugs targetten eiwitten
Proteome = het totaal aan eiwitten dat tot expressie wordt gebracht door het genoom in een cel,
weefsel, lichaamsvloeistof, biosysteem, etc.
Spatial proteomics > zet het eiwit in een biologische context en geeft mogelijke cellulaire functies >
beantwoordt vragen als:
- Waar en wanneer komt een eiwit tot expressie?
- Verandert de concentratie over tijd (is het eiwit statisch of dynamisch)?
- Hoe zijn de locatie en concentratie gerelateerd aan andere eiwitten en de biologie in het
algemeen?
Grote impact van Human Genome Project (HUGO):
- Stelde alle biomoleculen die worden gecodeerd door het genoom vast
- Versnelde de ontwikkeling van technologieën voor large-scale measurements voor verschillende
klassen van moleculen
- Nieuwe concepten > biologische processen werken als geïntegreerde systemen van
interacterende moleculen
Uniek aan het proteome:
- Proteome is dynamisch > spatiële en temporele eiwitexpressie
- Eiwitten hebben post-translationele modificaties (PTMs) > dynamische modificaties (zoals
fosforylering) of statische modificaties (zoals zwavelbruggen)
- Eiwitten functioneren in clusters /modules > verschillende soorten van interacterende eiwitten
Om deze redenen is het zeer onwaarschijnlijk dat er een unidirectionele/lineaire relatie bestaat
tussen genome, transcriptome en proteome. Deze 3 dingen zijn niet uit analyse van het genoom
op te maken. Het proteome heeft ook zijn eigen controle over biologische effecten.
Hoe proteomes te meten > massaspectrometrie (MS)
Challenges in proteome analyse:
- Je kunt eiwitten niet amplificeren > analyse moet hoge gevoeligheid hebben
- Eiwitten hebben verschillende oplosbaarheid > analyse moet gegeneraliseerd worden
, - Eiwitten kunnen gemodificeerd/geprocesst zijn > verschillend gemodificeerde/geprocesste
eiwitten moeten gedetecteerd en geïdentificeerd worden
Kwantificatie:
- Labeling > accurate, relatieve en absolute kwantificatie; specifieke of globale approaches kunnen
gebruikt worden
- Label-free > comparative (relatieve) measurements; spectral counting or ion current
Tegenwoordig meten we peptides (stukjes van eiwitten), maar er worden technieken ontwikkeld om
hele eiwitten te kunnen meten.
MS:
- Identificatie en kwantificatie van eiwitten die gerepresenteerd zijn in sequentiedatabanken
- Sequentie-informatie en eiwitidentificatie worden verkregen door verschillende manieren van
MS
- 3 essentiële componenten van massa spectrometer: ionisatie bron (hier worden moleculen
geïoniseerd), mass analyzer (hier worden ionen gescheiden op basis van m/z), detector
Moleculen in hun geïoniseerde toestand worden gemeten > hierdoor kan een peptide
versneld worden in een elektrisch of magnetisch veld
De waardes zijn ten opzichte van massa/lading (m/z) > de m/z heeft effect op de
beweging door het elektrische/magnetische veld
- Eiwitten geknipt in peptiden > gescheiden door LC (liquid chromatography) > geïoniseerd >
gefragmenteerd in de MS (>MS/MS)
- Bij fragmentatie wordt precursor ion (MS, peptide) omgezet in product ionen (MS/MS, peptide
fragmenten)
, - Massaspectrum is weergave van detectorrespons versus m/z:
- Moleculen moeten in gasvorm zijn bij ionisatie > meeste biomoleculen zijn nonvolatile en
verhitting zal zorgen voor fragmentatie, dus soft ionization-method nodig die niet zorgt voor
fragmentatie
MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionisation): sample (van eiwitten/peptide)
wordt in matrix gebracht > laser (meestal UV) erop > matrixmoleculen absorberen
energie > energie overgedragen op samplemoleculen > samplemoleculen worden
geïoniseerd (door 1 proton erop) + desorberen (laten los van target plate) >
samplemoleculen zijn nu in de gasfase
Samenvatting Garry Corthals
Waarom eiwitten bestuderen?
- Grote moleculen die bijna alle functies in het lichaam uitvoeren > structuur, signalering,
katalyse, immuniteit (antilichamen), regulatie, transport
- Eiwit dysfunctie is belangrijke oorzaak van ziekte
- De meeste drugs targetten eiwitten
Proteome = het totaal aan eiwitten dat tot expressie wordt gebracht door het genoom in een cel,
weefsel, lichaamsvloeistof, biosysteem, etc.
Spatial proteomics > zet het eiwit in een biologische context en geeft mogelijke cellulaire functies >
beantwoordt vragen als:
- Waar en wanneer komt een eiwit tot expressie?
- Verandert de concentratie over tijd (is het eiwit statisch of dynamisch)?
- Hoe zijn de locatie en concentratie gerelateerd aan andere eiwitten en de biologie in het
algemeen?
Grote impact van Human Genome Project (HUGO):
- Stelde alle biomoleculen die worden gecodeerd door het genoom vast
- Versnelde de ontwikkeling van technologieën voor large-scale measurements voor verschillende
klassen van moleculen
- Nieuwe concepten > biologische processen werken als geïntegreerde systemen van
interacterende moleculen
Uniek aan het proteome:
- Proteome is dynamisch > spatiële en temporele eiwitexpressie
- Eiwitten hebben post-translationele modificaties (PTMs) > dynamische modificaties (zoals
fosforylering) of statische modificaties (zoals zwavelbruggen)
- Eiwitten functioneren in clusters /modules > verschillende soorten van interacterende eiwitten
Om deze redenen is het zeer onwaarschijnlijk dat er een unidirectionele/lineaire relatie bestaat
tussen genome, transcriptome en proteome. Deze 3 dingen zijn niet uit analyse van het genoom
op te maken. Het proteome heeft ook zijn eigen controle over biologische effecten.
Hoe proteomes te meten > massaspectrometrie (MS)
Challenges in proteome analyse:
- Je kunt eiwitten niet amplificeren > analyse moet hoge gevoeligheid hebben
- Eiwitten hebben verschillende oplosbaarheid > analyse moet gegeneraliseerd worden
, - Eiwitten kunnen gemodificeerd/geprocesst zijn > verschillend gemodificeerde/geprocesste
eiwitten moeten gedetecteerd en geïdentificeerd worden
Kwantificatie:
- Labeling > accurate, relatieve en absolute kwantificatie; specifieke of globale approaches kunnen
gebruikt worden
- Label-free > comparative (relatieve) measurements; spectral counting or ion current
Tegenwoordig meten we peptides (stukjes van eiwitten), maar er worden technieken ontwikkeld om
hele eiwitten te kunnen meten.
MS:
- Identificatie en kwantificatie van eiwitten die gerepresenteerd zijn in sequentiedatabanken
- Sequentie-informatie en eiwitidentificatie worden verkregen door verschillende manieren van
MS
- 3 essentiële componenten van massa spectrometer: ionisatie bron (hier worden moleculen
geïoniseerd), mass analyzer (hier worden ionen gescheiden op basis van m/z), detector
Moleculen in hun geïoniseerde toestand worden gemeten > hierdoor kan een peptide
versneld worden in een elektrisch of magnetisch veld
De waardes zijn ten opzichte van massa/lading (m/z) > de m/z heeft effect op de
beweging door het elektrische/magnetische veld
- Eiwitten geknipt in peptiden > gescheiden door LC (liquid chromatography) > geïoniseerd >
gefragmenteerd in de MS (>MS/MS)
- Bij fragmentatie wordt precursor ion (MS, peptide) omgezet in product ionen (MS/MS, peptide
fragmenten)
, - Massaspectrum is weergave van detectorrespons versus m/z:
- Moleculen moeten in gasvorm zijn bij ionisatie > meeste biomoleculen zijn nonvolatile en
verhitting zal zorgen voor fragmentatie, dus soft ionization-method nodig die niet zorgt voor
fragmentatie
MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionisation): sample (van eiwitten/peptide)
wordt in matrix gebracht > laser (meestal UV) erop > matrixmoleculen absorberen
energie > energie overgedragen op samplemoleculen > samplemoleculen worden
geïoniseerd (door 1 proton erop) + desorberen (laten los van target plate) >
samplemoleculen zijn nu in de gasfase
