Deeltoets twee
Micro-organismen:
- Organismen die te klein zijn om met het blote oog te zien
- Prokaryoten: bacteriën en archea
- Eukaryoten: schimmels, protisten (o.a. algen)
- Enorme (metabolische) diversiteit
- Groeien snel
- Genetisch toegankelijk
- Belangrijke modelsystemen voor onderzoek: E. coli bacterie en S. cerevisae gist.
Soorten bactieriën:
Gram-positief: dikke laag peptifoglycaan, zonder celwand
Gram-negatief: dunnere laag peptidoglycaan, met wand die tegen antibiotica
kan
Wat het biotechnologisch product is van de kweek van micro-organismen, verschilt:
- Hele cellen. Zoals yakult of een zakje gist.
- Omzetting die een micro-organisme kan doen. Bijvoorbeeld bij de synthese van steroid
hormonen zoals pretnison. Dit is een ingewikkeld en duur proces, maar kan veel
goedkoper door gebruik te maken van synthetiserende micro-organismen.
- Iets wat door de cel gemaakt wordt. Zoals primaire metabolieten: alcohol, citroenzuur,
AZ’s en vitaminen of secundaire metabolieten: antibiotica en enzymen.
De productie van voedsel (fermentatie):
• De oudste vorm van biotechnologie
• Micro-organismen breken suikers af onder anaerobe condities
• Twee vormen van fermentatie: melkzuur (lactic acid) en alcohol (nodig voor productie
van NADH)
1
,Toepassing van enzymen:
• Moleculair onderzoek, zoals restrictie-enzymen, ligase, Taq polymerase
• Cellulases worden gebruikt voor productie van stonewashed jeans
• Lactases voor lactose vrije melk
• Proteases voor wasmiddel en bier
Extremofielen (archea), vooral thermofielen, zijn erg handig bij onderzoek. Echter zijn deze moeilijk
te kweken. Er wordt daarom DNA geïsoleerd uit de leefomgeving van de archea, wat vervolgens
wordt gekloneerd en waarvan de nucleotidevolgorde wordt bepaald. Je gaat dan op zoek naar de
genen die coderen voor het enzym wat je nodig hebt. Dat doe je door de sequenties te vergelijken
met die voor bekende enzymen.
Het inbrengen van genen in bacteriën
- CaCl2 methode (bacteriën):
• Maken van competente cellen door cellen op te nemen uit CaCl2 oplossing
• Mengen van competente cellen en plasmide. Dit mengsel laat je even staan op ijs.
• Je geeft een hitteshock (42°C) voor 1 minuut
• Incubeer voor 1 uur bij 37°C
• Uitplaten op voedingsbodem met antibioticum (zo selecteren op de cellen die het
plasmide hebben opgenomen, dus selectiemarker op het plasmide)
Er wordt gedacht dat het plasmide wordt opgenomen doordat er bij de shock gaatjes in de
celwand ontstaan, waardoor het plasmide binnen kan treden.
- Elektroporatie (eukaryote micro-organismen):
• Celen mengen met het in te brengen plasmide in een cuvet
• Korte elektrische shock, waardoor de cellen even permiabel zijn
• Cellen worden in medium gezet en worden 1 uur bij 37°C laten staan
• Wederom uitplaten op voedingsbodem met antibioticum.
Electroporatie is sneller en efficiënter; er zijn meer cellen die het plasmide opnemen. Verder
is het grootste voordeel dat deze methode ook werkt bij eukaryote cellen en archea.
Het maken van mutaties in bacteriën kan ervoor zorgen dat een bactie efficiënter te werk gaat voor
het product wat men nodig heeft. Zo is de stam die peniceline maakt zo gemuteerd dat het nu 1000x
zoveel peniceline produceert. Je kunt op deze manier ook ongewenste mutaties uitschakelen. Dit
doen d.m.v. random mutaties kan door een mutagene stof toe te voegen of UV licht te gebruiken. Dit
is niet heel handig, omdat je dan niet zeker weet welk gen je modificeert.
Het gericht uitschakelen van genen kan d.m.v. homologe recombinatie:
• Gen x op het plasmide kloneren
• Gen inactiveren door het open te knippen en er iets in te zetten, zoals resistentie
• Plasmide lineair knippen
• Op een paar plekken in het genoom zal homologe recombinantie optreden, omdat de
sequentie hier op elkaar lijkt. Hierdoor wordt het stukje geïnactieveerde gen met
plasmide in het genoom opgenomen.
• Het kleine aantal cellen waarbij dit gebeurt kun je eruit selecteren d.m.v. de resistentie
Stel je wilt een gen in het chromosoom inbrengen, dan gebruik je homologe recombinatie.
2
, De productie van insuline in E. coli wordt gedaan door het introduceren van het menselijk gen wat
codeert voor insuline in het genoom van E. coli te zetten. In de mens wordt insuline gemaakt als een
lange polypeptide keten, bestaande uit een A en B deel. Dit kan E. coli niet zomaar doen. Ze hebben
E. coli dus in twee stappen apart laten maken, de A en B ketens apart van elkaar met Béta-galactose
eraan. Dit b-galactose wordt eraf gehaald en de A en B worden onder oxiderende condities
samengevoegd.
Het toevoegen van de b-galactosegroep beschermt de ketens tegen proteases. Omdat het eiwit een
eiwit is van E. coli, vouwt dit ook goed. De fusieeiwitten kunnen zo ook makkelijker worden
gezuiverd, doordat ze met antilichamen eruit worden gehaald.
Fusie eiwitten
- Fuseren van een gen met een tag-eiwit.
- De functie is het vergemakkelijken van het zuiveren van het eiwit of detectie van het eiwit.
Door dit te doen kun je makkelijk zuiveren door middel van affiniteitschromatochrafie.
Hierbij maak je gebruik van antilichamen tegen het fusiegen.
- B-galactosidase is een voorbeeld een tag-eiwit.
- Histidine tag is een voorbeeld van een korte tag en bindt aan nikkel en is zo dus te
zuiveren. Vaak kun je zo’n tag aan een eiwit zetten zonder dat dat eiwit zijn functie
verliest. Je hoeft het er dan later niet af te halen.
Reporter eiwitten zijn eiwitten die makkelijk
de tetecteren zijn. B-galactosidase is hier een
voorbeeld van. Echter is luciferase nog beter
te detecteren, want deze geven licht. De
genen hiervoor verantwoordelijk zijn de Lux
genen. Als je reportergenen fuseert met een
eiwit, kun je de locatie van dat eiwit
achterhalen. Ook kun je de transcriptie
onderzoeken hiermee, namelijk door een het
gen voor een reporter achter de promotor zetten.
Yeast two-hybrid systeem:
• Er wordt gebruikt gemaakt van een reporter en fusie-eiwitten.
• Hiermee kun je bepalen of twee eiwitten een interactie met elkaar aangaan.
• Het bestaat uit een promotor met daarachter een reportergen.
• De transcriptiefactor Gal-4 reguleert de promotor. Het bestaat uit twee domeinen: het
DNA-bindend domeun (DBD) en een activator domein (AD). Er is alleen activatie van
transcriptie als de domeinen bij elkaar in de buurt zijn.
• De domeinen worden dan aan twee eiwitten gekoppeld waarvan je wilt weten of ze een
interactie met elkaar aangaan (dus bijv: DBD aan eiwit A. AD aan eiwit B).
➔ Bij binden van A en B vind er transcriptie plaats van het reportergen (en gaat het
mengsel bijvoorbeeld licht geven).
Metagenomics: het sequencen van hele populaties micro-organismen (zoals het human microbiome
project, waarbij het hele microbioom van de mens in kaart is gelegd).
Synthetische biologie: het ontwerpen van organismen en maken van biollogische systemen voor
toepassingen. Craig Venter maakte de constructie van het eerste synthetische organisme. Hierbij
nam hij:
• De bacterie met het allerkleinste genoom
3
Micro-organismen:
- Organismen die te klein zijn om met het blote oog te zien
- Prokaryoten: bacteriën en archea
- Eukaryoten: schimmels, protisten (o.a. algen)
- Enorme (metabolische) diversiteit
- Groeien snel
- Genetisch toegankelijk
- Belangrijke modelsystemen voor onderzoek: E. coli bacterie en S. cerevisae gist.
Soorten bactieriën:
Gram-positief: dikke laag peptifoglycaan, zonder celwand
Gram-negatief: dunnere laag peptidoglycaan, met wand die tegen antibiotica
kan
Wat het biotechnologisch product is van de kweek van micro-organismen, verschilt:
- Hele cellen. Zoals yakult of een zakje gist.
- Omzetting die een micro-organisme kan doen. Bijvoorbeeld bij de synthese van steroid
hormonen zoals pretnison. Dit is een ingewikkeld en duur proces, maar kan veel
goedkoper door gebruik te maken van synthetiserende micro-organismen.
- Iets wat door de cel gemaakt wordt. Zoals primaire metabolieten: alcohol, citroenzuur,
AZ’s en vitaminen of secundaire metabolieten: antibiotica en enzymen.
De productie van voedsel (fermentatie):
• De oudste vorm van biotechnologie
• Micro-organismen breken suikers af onder anaerobe condities
• Twee vormen van fermentatie: melkzuur (lactic acid) en alcohol (nodig voor productie
van NADH)
1
,Toepassing van enzymen:
• Moleculair onderzoek, zoals restrictie-enzymen, ligase, Taq polymerase
• Cellulases worden gebruikt voor productie van stonewashed jeans
• Lactases voor lactose vrije melk
• Proteases voor wasmiddel en bier
Extremofielen (archea), vooral thermofielen, zijn erg handig bij onderzoek. Echter zijn deze moeilijk
te kweken. Er wordt daarom DNA geïsoleerd uit de leefomgeving van de archea, wat vervolgens
wordt gekloneerd en waarvan de nucleotidevolgorde wordt bepaald. Je gaat dan op zoek naar de
genen die coderen voor het enzym wat je nodig hebt. Dat doe je door de sequenties te vergelijken
met die voor bekende enzymen.
Het inbrengen van genen in bacteriën
- CaCl2 methode (bacteriën):
• Maken van competente cellen door cellen op te nemen uit CaCl2 oplossing
• Mengen van competente cellen en plasmide. Dit mengsel laat je even staan op ijs.
• Je geeft een hitteshock (42°C) voor 1 minuut
• Incubeer voor 1 uur bij 37°C
• Uitplaten op voedingsbodem met antibioticum (zo selecteren op de cellen die het
plasmide hebben opgenomen, dus selectiemarker op het plasmide)
Er wordt gedacht dat het plasmide wordt opgenomen doordat er bij de shock gaatjes in de
celwand ontstaan, waardoor het plasmide binnen kan treden.
- Elektroporatie (eukaryote micro-organismen):
• Celen mengen met het in te brengen plasmide in een cuvet
• Korte elektrische shock, waardoor de cellen even permiabel zijn
• Cellen worden in medium gezet en worden 1 uur bij 37°C laten staan
• Wederom uitplaten op voedingsbodem met antibioticum.
Electroporatie is sneller en efficiënter; er zijn meer cellen die het plasmide opnemen. Verder
is het grootste voordeel dat deze methode ook werkt bij eukaryote cellen en archea.
Het maken van mutaties in bacteriën kan ervoor zorgen dat een bactie efficiënter te werk gaat voor
het product wat men nodig heeft. Zo is de stam die peniceline maakt zo gemuteerd dat het nu 1000x
zoveel peniceline produceert. Je kunt op deze manier ook ongewenste mutaties uitschakelen. Dit
doen d.m.v. random mutaties kan door een mutagene stof toe te voegen of UV licht te gebruiken. Dit
is niet heel handig, omdat je dan niet zeker weet welk gen je modificeert.
Het gericht uitschakelen van genen kan d.m.v. homologe recombinatie:
• Gen x op het plasmide kloneren
• Gen inactiveren door het open te knippen en er iets in te zetten, zoals resistentie
• Plasmide lineair knippen
• Op een paar plekken in het genoom zal homologe recombinantie optreden, omdat de
sequentie hier op elkaar lijkt. Hierdoor wordt het stukje geïnactieveerde gen met
plasmide in het genoom opgenomen.
• Het kleine aantal cellen waarbij dit gebeurt kun je eruit selecteren d.m.v. de resistentie
Stel je wilt een gen in het chromosoom inbrengen, dan gebruik je homologe recombinatie.
2
, De productie van insuline in E. coli wordt gedaan door het introduceren van het menselijk gen wat
codeert voor insuline in het genoom van E. coli te zetten. In de mens wordt insuline gemaakt als een
lange polypeptide keten, bestaande uit een A en B deel. Dit kan E. coli niet zomaar doen. Ze hebben
E. coli dus in twee stappen apart laten maken, de A en B ketens apart van elkaar met Béta-galactose
eraan. Dit b-galactose wordt eraf gehaald en de A en B worden onder oxiderende condities
samengevoegd.
Het toevoegen van de b-galactosegroep beschermt de ketens tegen proteases. Omdat het eiwit een
eiwit is van E. coli, vouwt dit ook goed. De fusieeiwitten kunnen zo ook makkelijker worden
gezuiverd, doordat ze met antilichamen eruit worden gehaald.
Fusie eiwitten
- Fuseren van een gen met een tag-eiwit.
- De functie is het vergemakkelijken van het zuiveren van het eiwit of detectie van het eiwit.
Door dit te doen kun je makkelijk zuiveren door middel van affiniteitschromatochrafie.
Hierbij maak je gebruik van antilichamen tegen het fusiegen.
- B-galactosidase is een voorbeeld een tag-eiwit.
- Histidine tag is een voorbeeld van een korte tag en bindt aan nikkel en is zo dus te
zuiveren. Vaak kun je zo’n tag aan een eiwit zetten zonder dat dat eiwit zijn functie
verliest. Je hoeft het er dan later niet af te halen.
Reporter eiwitten zijn eiwitten die makkelijk
de tetecteren zijn. B-galactosidase is hier een
voorbeeld van. Echter is luciferase nog beter
te detecteren, want deze geven licht. De
genen hiervoor verantwoordelijk zijn de Lux
genen. Als je reportergenen fuseert met een
eiwit, kun je de locatie van dat eiwit
achterhalen. Ook kun je de transcriptie
onderzoeken hiermee, namelijk door een het
gen voor een reporter achter de promotor zetten.
Yeast two-hybrid systeem:
• Er wordt gebruikt gemaakt van een reporter en fusie-eiwitten.
• Hiermee kun je bepalen of twee eiwitten een interactie met elkaar aangaan.
• Het bestaat uit een promotor met daarachter een reportergen.
• De transcriptiefactor Gal-4 reguleert de promotor. Het bestaat uit twee domeinen: het
DNA-bindend domeun (DBD) en een activator domein (AD). Er is alleen activatie van
transcriptie als de domeinen bij elkaar in de buurt zijn.
• De domeinen worden dan aan twee eiwitten gekoppeld waarvan je wilt weten of ze een
interactie met elkaar aangaan (dus bijv: DBD aan eiwit A. AD aan eiwit B).
➔ Bij binden van A en B vind er transcriptie plaats van het reportergen (en gaat het
mengsel bijvoorbeeld licht geven).
Metagenomics: het sequencen van hele populaties micro-organismen (zoals het human microbiome
project, waarbij het hele microbioom van de mens in kaart is gelegd).
Synthetische biologie: het ontwerpen van organismen en maken van biollogische systemen voor
toepassingen. Craig Venter maakte de constructie van het eerste synthetische organisme. Hierbij
nam hij:
• De bacterie met het allerkleinste genoom
3
