Samenvatting Genoom (BMW21614)

DNA-technieken
 Onderzoek
o PCR
o Restrictie-enzymen
o DNA-gelelectroforese
o Genomische banken en cDNA banken
o Overexpressie
o Fusie-eiwitten
o Reporter-genen
o Sanger sequencing
o Next Generation Sequencing
 Manipulatie
o Restrictie-enzymen
o DNA-klonering
o Plaatsgerichte mutagenese
o Overexpressie
o RNA-interferentie (shRNA’s)
o CRISPR/Cas9 gene editing

RNA-technieken
 In-situ hybridisatie
 RT-PCR
 cDNA
 RNA-seq

Manipulatie/onderzoekstechnieken
 RNA-interferentie
 Plasmides, kloneren, kloneringsvectoren, expressievectoren, cDNA-banken, genomische banken
 Fusie-eiwitten
 Reporter-genen (GFP)
 Inductie van bèta-galactosidase, spectrofotometer
 SDS-PAGE en Western Blot
 GST-pull down
 Co-IP
 ChIP
 CRISPR/Cas9 gene editing

(In-situ) hybridisatie
 Doel: lokalisatie RNA of DNA
 Methode:
o Inbrengen korte stukjes fluorescerend DNA of RNA
o DNA: uitsmelten
o Hybridisatie op specifieke sequentie

PCR
 Doel: DNA selecteren en vermeerderen voor onderzoek
 Methode: thermocycling
o Denaturatie: dubbelstrengs  enkelstrengs
o Annealing: baseparing primers

, o Elongation: enkelstrengs  dubbelstrengs
 Benodigdheden:
o DNA-fragment dat je wil vermeerderen
o Forward en reverse primer (die aan 3’ kant van fragment binden op beide strengen)
o DNA-polymerase
o dNTP’s
o Buffer
o Water
 Voorwaarden primers:
o Complementair aan beide kanten gen
o Niet complementair aan elkaar
o Geen interne baseparing
o 15-30 baseparen lang
o Zo veel mogelijk uit G en C

RT-PCR
 Doel: RNA selecteren, vermeerderen en vergelijken
 RNA te instabiel als fragment in PCR  RT-PCR
 Methode: maken van cDNA
o Isoleren (m)RNA
o (m)RNA  RNA/DNA met reverse transcriptase en poly-T-primer (bindt poly-A-staart)
o RNA/DNA  DNA/DNA met RNA degradatie en DNA-polymerase (RNA als primer)
 Welke cDNA’s dit oplevert is afhankelijk van de aanwezige RNA’s in het sample zaten
 Kwantitatieve RT-PCR
o Twee cDNA’s worden vermeerderd met PCR
o Toevoegen eiwit dat fluoresceert als het dubbelstrengs DNA bindt
o Hoe meer DNA  hoe meer fluorescentie
o Aantal cycli nodig om maximale fluorescentie te berijken: mate voor hoeveelheid mRNA
in sample

Plaats-specifieke mutagenese
 Doel: specifieke mutatie aanbrengen
 Methode:
o PCR met gemuteerde primer
o Primer bindt specifieke sequentie  mutatie
o Replicatie
o Verwijderen bacterieel (gemethyleerd) DNA met DNP1

Restrictie-enzymen
 Herkennen palindromische sequentie in DNA
o Sticky ends: 3’ of 5’ overhang
 5’ overhang kan blunt gemaakt worden
 3’ overhang niet
o Blunt ends: geen overhang
 Doelen:
o Inbrengen gen in expressievector
o Sequentie-onderzoek: knipt enzym wel of niet
 Methode: inbrengen gen in expressievector
o Restrictie-enzymen: knip gen uit insert vector