Practicum 1: Eiwitten
Werkgroep 6
Assistent:
, Samenvatting
In dit practicum is er onderzoek gedaan naar het gewicht en de structuur van een bepaald
eiwit en is de eiwitconcentratie van kalverserum bepaald. De eiwitstructuur is bepaald door
het eiwit in gereduceerde en niet-gereduceerde vorm te analyseren met behulp van een
SDS-PAGE en een Western Blot. De eiwitconcentratie van kalverserum is bepaald met
behulp van spectrofotometrie. Uit de resultaten van de SDS-PAGE en de Western Blot is
gebleken dat eiwit “x” 63 kDa weegt en dat eiwit “y” 250 kDa weegt en uit 5 subunits bestaat
die door zwavelbruggen verbonden worden. Uit de resultaten van de spectrofotometrie is
gebleken dat de eiwitconcentratie van kalverserum 40 gram per liter is.
Inleiding
Met SDS-PAGE kunnen eiwitten op grootte gescheiden worden. SDS bindt aan de eiwitten
en zorgt ervoor dat de eiwitten een negatieve lading krijgen. Als de eiwitten aangebracht
worden op een polyacrylamide gel en er met een anode en kathode een elektrische stroom
over de gel gezet wordt, zullen de eiwitten naar de kathode (de positieve pool) toe migreren.
Aangezien grote eiwitten langzamer migreren dan kleine eiwitten, kan het molecuulgewicht
van de eiwitten afgeleid worden van hun loopafstand over de gel (1).
De Western Blot is een vervolgstap op de SDS-PAGE. Na de SDS-PAGE worden de eiwitten
overgebracht op een membraan. Op dit membraan kan een specifiek eiwit aangetoond
worden door het toevoegen van een antilichaam dat bindt aan dit eiwit (1).
Spectrofotometrie kan gebruikt worden om de concentratie van een opgeloste stof te
bepalen, door te meten hoeveel licht met een bepaalde golflengte er door deze stof wordt
geabsorbeerd. Zo kunnen eiwitconcentraties in bijvoorbeeld cellen ook gemeten worden.
Enzymatische reacties kunnen ook gevolgd worden door spectrofotometrie, door de
absorptie te meten van een stof die bij een enzymatische reactie ontstaat (1).
Met behulp van deze technieken zullen in dit practicum de volgende twee vraagstellingen
beantwoord worden:
1) Hoe kan met behulp van SDS-PAGE en Western Blot het gewicht en de structuur van
eiwit “y” worden bepaald?
2) Hoe kan met behulp van spectrofotometrie de eiwitconcentratie van kalverserum worden
bepaald?
Resultaten
SDS-PAGE en Western Blot
Figuur 1: SDS-PAGE gekleurd met Simply Blue
Tabel 1: Molecuulgewichten en loopafstanden markereiwitten
Molecuulgewicht (kDa) Loopafstand (cm)
250 0,4
150 0,8
Werkgroep 6
Assistent:
, Samenvatting
In dit practicum is er onderzoek gedaan naar het gewicht en de structuur van een bepaald
eiwit en is de eiwitconcentratie van kalverserum bepaald. De eiwitstructuur is bepaald door
het eiwit in gereduceerde en niet-gereduceerde vorm te analyseren met behulp van een
SDS-PAGE en een Western Blot. De eiwitconcentratie van kalverserum is bepaald met
behulp van spectrofotometrie. Uit de resultaten van de SDS-PAGE en de Western Blot is
gebleken dat eiwit “x” 63 kDa weegt en dat eiwit “y” 250 kDa weegt en uit 5 subunits bestaat
die door zwavelbruggen verbonden worden. Uit de resultaten van de spectrofotometrie is
gebleken dat de eiwitconcentratie van kalverserum 40 gram per liter is.
Inleiding
Met SDS-PAGE kunnen eiwitten op grootte gescheiden worden. SDS bindt aan de eiwitten
en zorgt ervoor dat de eiwitten een negatieve lading krijgen. Als de eiwitten aangebracht
worden op een polyacrylamide gel en er met een anode en kathode een elektrische stroom
over de gel gezet wordt, zullen de eiwitten naar de kathode (de positieve pool) toe migreren.
Aangezien grote eiwitten langzamer migreren dan kleine eiwitten, kan het molecuulgewicht
van de eiwitten afgeleid worden van hun loopafstand over de gel (1).
De Western Blot is een vervolgstap op de SDS-PAGE. Na de SDS-PAGE worden de eiwitten
overgebracht op een membraan. Op dit membraan kan een specifiek eiwit aangetoond
worden door het toevoegen van een antilichaam dat bindt aan dit eiwit (1).
Spectrofotometrie kan gebruikt worden om de concentratie van een opgeloste stof te
bepalen, door te meten hoeveel licht met een bepaalde golflengte er door deze stof wordt
geabsorbeerd. Zo kunnen eiwitconcentraties in bijvoorbeeld cellen ook gemeten worden.
Enzymatische reacties kunnen ook gevolgd worden door spectrofotometrie, door de
absorptie te meten van een stof die bij een enzymatische reactie ontstaat (1).
Met behulp van deze technieken zullen in dit practicum de volgende twee vraagstellingen
beantwoord worden:
1) Hoe kan met behulp van SDS-PAGE en Western Blot het gewicht en de structuur van
eiwit “y” worden bepaald?
2) Hoe kan met behulp van spectrofotometrie de eiwitconcentratie van kalverserum worden
bepaald?
Resultaten
SDS-PAGE en Western Blot
Figuur 1: SDS-PAGE gekleurd met Simply Blue
Tabel 1: Molecuulgewichten en loopafstanden markereiwitten
Molecuulgewicht (kDa) Loopafstand (cm)
250 0,4
150 0,8
