Maandag 23 november 2015
Chapter 10: gene isolation and manipulation
DNA technologie: technieken om DNA te isoleren amplificeren, combineren en
manipuleren
Gereedschap: eiwitten uit organismen zoals restrictie enzymen, DNA polymerases,
ligases, etc. (worden vooral uit prokaryoten gehaald)
Genetic engineering: toepassing op specifieke bio/medische en land/tuinbouw
problemen
DNA palindrome: beiden DNA strengen hebben dezelfde nucleotide maar in
tegengestelde richting.
Recombinant DNA technologie is een van de meest gebruikte technieken in het
onderzoek en in de biotech industrie: dna van verschillende bronnen kan gecombineerd
worden en overgedragen worden naar andere organismen
- genomisch DNA
- specifiek dna
- mRNA
Bronnen van donor DNA:
1. maken van een recombinant DNA molecuul kan gedaan worden door knippen en
plakken. Restrictie enzymen kunnen knippen op herkenning sequenties. Ze
kunnen knippen door fosfordiester te knippen tussen AG van een palindrome, de
andere aminozuren van tegenoverliggende DNA streng kunnen dan aan elkaar
plakken door waterstofbindingen, op die manier kun je DNA aan elkaar laten
vastplakken. Elk restrictie enzym heeft zijn eigen herkenningspunt (volgorde van
base). Ze knippen dus op verschillende plekken. (figuur 10-2)
DNA ligase is het enzym dat onder hydrolyse van ATP de fosfaatbinding kan herstellen
en op deze manier stukken DNA aan elkaar kan plakken
2. PCR kan heel makkelijk het stuk DNA waar jij geïnteresseerd in bent maken. Je
moet een oligonucleotide (primer) maken die kan paren met het stukje waar jij in
geïnteresseerd bent. Vervolgens voeg je DNA polymerase en nucleotide toe die
vervolgens het stukje DNA vanaf de primer kan kopiëren, hierbij ontstaat een
kopie van het gedeelde die je wilt. Vervolgens verhit je het naar 95 graden zodat
het twee losse strengen worden. Door de aanwezigheid van nog steeds de
primers kan dit weer helemaal opnieuw afgespeeld worden tot je genoeg DNA
kopieën hebt. (figuur 10-3)
, 3. NA kopieën van het mRNA product,genaamd cDNA, kunnen gemaakt worden en
geplaats worden in een vector. Dit is handig aangezien het mRNA geen intronen bevat.
cDNA wordt gemaakt van mRNA door middel van een speciaal enzym: terugwerkende
transcripase. Doordat de OligodT primer hecht aan de polyA staart,
kan de transcriptie beginnen. Als deze transcriptie gedaan is, wordt er vanaf de andere
kant ook overgeschreven waardoor je uiteindelijk twee nieuwe strengen DNA tegenover
elkaar hebt. (figuur 10-4)
Je wilt juist een sticky end hebben omdat je op die manier de enkele streng aan een
nieuwe streng kan binden door waterstofbruggen om op die manier een recombinant te
krijgen (hybridization). Door PCR wordt een recht stuk geknipt door beide DNA
strengen. Door een speciale primer in en PCR toe te voegen die restrictie endonuclease
volgorde herkent (EcoRI) worden fragmenten gemaakt die klaar zijn om bewerkt te
worden voor een sticky end (figuur 10-6)
Ook: Met ligase kun je bijvoorbeeld aan 1 streng een extra stuk DNA plakken om voor
zo’n sticky end te zorgen. Ook kan in 1 streng DNA nog een keer geknipt worden zodat
die streng korter wordt dan de andere streng en er ook een sticky end ontstaat.
Eisen waar een vector aan moet voldoen:
1. origin van replicatie
2. hoog kopie aantal
3. selectie marker
4. unieke restrictie sites om nieuw DNA te plakken
5. eenvoudige methode om vast te stellen of een nieuw stuk DNA is opgenomen
Op 3 manieren kan een recombinant DNA molecuul worden opgenomen in een bacterial
cell(figuur 10-11);
1. transformation: recombinant Plasmide & BACs vectors. Door electroporation
kan een plasmide of BAC door het membraan de cel in waarna het een plasmide
chromosoom is.
2. transduction: wordt er een virus gevormd met het recombinant DNA, dit virus
infecteert vervolgens de bacterie cel waardoor het dna in de cel komt.
3. Infection: in tegenstelling tot transduction kunnen er door dit type virus wel
nieuwe virussen ontstaan.
DNA-bibliotheek
Met behulp van een vector kan een verzameling van DNA fragmenten uit een genoom
van een organisme gemaakt worden. Dit wordt een bank of bibliotheek genoemd.
Bacteriën kunnen ingevroren worden en weer tot leven geroepen worden. Op die manier
is het opslaan van een bank eenvoudig.
Expressie vectoren bevatten signalen voor transcriptie en translatie van het
gekloneerde gen. Verschillende vectoren hebben verschillende eigenschappen
Chapter 10: gene isolation and manipulation
DNA technologie: technieken om DNA te isoleren amplificeren, combineren en
manipuleren
Gereedschap: eiwitten uit organismen zoals restrictie enzymen, DNA polymerases,
ligases, etc. (worden vooral uit prokaryoten gehaald)
Genetic engineering: toepassing op specifieke bio/medische en land/tuinbouw
problemen
DNA palindrome: beiden DNA strengen hebben dezelfde nucleotide maar in
tegengestelde richting.
Recombinant DNA technologie is een van de meest gebruikte technieken in het
onderzoek en in de biotech industrie: dna van verschillende bronnen kan gecombineerd
worden en overgedragen worden naar andere organismen
- genomisch DNA
- specifiek dna
- mRNA
Bronnen van donor DNA:
1. maken van een recombinant DNA molecuul kan gedaan worden door knippen en
plakken. Restrictie enzymen kunnen knippen op herkenning sequenties. Ze
kunnen knippen door fosfordiester te knippen tussen AG van een palindrome, de
andere aminozuren van tegenoverliggende DNA streng kunnen dan aan elkaar
plakken door waterstofbindingen, op die manier kun je DNA aan elkaar laten
vastplakken. Elk restrictie enzym heeft zijn eigen herkenningspunt (volgorde van
base). Ze knippen dus op verschillende plekken. (figuur 10-2)
DNA ligase is het enzym dat onder hydrolyse van ATP de fosfaatbinding kan herstellen
en op deze manier stukken DNA aan elkaar kan plakken
2. PCR kan heel makkelijk het stuk DNA waar jij geïnteresseerd in bent maken. Je
moet een oligonucleotide (primer) maken die kan paren met het stukje waar jij in
geïnteresseerd bent. Vervolgens voeg je DNA polymerase en nucleotide toe die
vervolgens het stukje DNA vanaf de primer kan kopiëren, hierbij ontstaat een
kopie van het gedeelde die je wilt. Vervolgens verhit je het naar 95 graden zodat
het twee losse strengen worden. Door de aanwezigheid van nog steeds de
primers kan dit weer helemaal opnieuw afgespeeld worden tot je genoeg DNA
kopieën hebt. (figuur 10-3)
, 3. NA kopieën van het mRNA product,genaamd cDNA, kunnen gemaakt worden en
geplaats worden in een vector. Dit is handig aangezien het mRNA geen intronen bevat.
cDNA wordt gemaakt van mRNA door middel van een speciaal enzym: terugwerkende
transcripase. Doordat de OligodT primer hecht aan de polyA staart,
kan de transcriptie beginnen. Als deze transcriptie gedaan is, wordt er vanaf de andere
kant ook overgeschreven waardoor je uiteindelijk twee nieuwe strengen DNA tegenover
elkaar hebt. (figuur 10-4)
Je wilt juist een sticky end hebben omdat je op die manier de enkele streng aan een
nieuwe streng kan binden door waterstofbruggen om op die manier een recombinant te
krijgen (hybridization). Door PCR wordt een recht stuk geknipt door beide DNA
strengen. Door een speciale primer in en PCR toe te voegen die restrictie endonuclease
volgorde herkent (EcoRI) worden fragmenten gemaakt die klaar zijn om bewerkt te
worden voor een sticky end (figuur 10-6)
Ook: Met ligase kun je bijvoorbeeld aan 1 streng een extra stuk DNA plakken om voor
zo’n sticky end te zorgen. Ook kan in 1 streng DNA nog een keer geknipt worden zodat
die streng korter wordt dan de andere streng en er ook een sticky end ontstaat.
Eisen waar een vector aan moet voldoen:
1. origin van replicatie
2. hoog kopie aantal
3. selectie marker
4. unieke restrictie sites om nieuw DNA te plakken
5. eenvoudige methode om vast te stellen of een nieuw stuk DNA is opgenomen
Op 3 manieren kan een recombinant DNA molecuul worden opgenomen in een bacterial
cell(figuur 10-11);
1. transformation: recombinant Plasmide & BACs vectors. Door electroporation
kan een plasmide of BAC door het membraan de cel in waarna het een plasmide
chromosoom is.
2. transduction: wordt er een virus gevormd met het recombinant DNA, dit virus
infecteert vervolgens de bacterie cel waardoor het dna in de cel komt.
3. Infection: in tegenstelling tot transduction kunnen er door dit type virus wel
nieuwe virussen ontstaan.
DNA-bibliotheek
Met behulp van een vector kan een verzameling van DNA fragmenten uit een genoom
van een organisme gemaakt worden. Dit wordt een bank of bibliotheek genoemd.
Bacteriën kunnen ingevroren worden en weer tot leven geroepen worden. Op die manier
is het opslaan van een bank eenvoudig.
Expressie vectoren bevatten signalen voor transcriptie en translatie van het
gekloneerde gen. Verschillende vectoren hebben verschillende eigenschappen
