Samenvatting cytologie cel II prof. Van Hengel

Samenvatting cytologie cel II (2017-2018)
Hoofdstuk 1: inleiding & techniek

a) Prepareren en observeren van cellen en weefsels
- Doel: cellen observeerbaar maken voor LM of EM
- Probleem: weefsel laat weinig licht/elektronen door & weinig contrast
- Oplossing: dun snijden en voldoende contrast aanbrengen

1) Fixeren
• Probleem: weefsel uit normale in vivo  afbraakenzymen actief  degradatie
• Oplossing: denaturatie van EW (enzymen stoppen)
o Koude fixatie: bevriezen van weefsel in vloeibare N2 (snel)
o Chemische fixatiemiddelen:
- EW cross-linken met formol, formaldehyde en glutaraldehyde
- EW neerslaan = precipiteren met alcohol of aceton
• Gevolg: enzymreacties worden gestopt & structurele componenten bewaard
• Nadeel: artefacten = veranderingen die tijdens fixatie zijn ontstaan
(structuurveranderingen (ontstaan lacune) of verplaatsing v componenten)

2) Inbedden
• Wat: gefixeerde materiaal omwikkelen en doordringen met inbedmiddel
• Inbedmiddel:
o substantie die in het weefsel indringt
o substantie die hard wordt
o materiaal snijdbaar in coupes (dunne plakjes)
o paraffine (meest gebruikt,LM), hars, plastics (EM)
o inbedmiddel = hydrofoob
 krijg je niet in weefsel want > 60% H2O  H2O onttrekken (dehydratatie)
 reeks alcoholbaden (30-50-70-90%, absolute ethanol)
 water vervangen door ethanol  clearing met tolueen (alcohol verwijderen)
(tolueen is mengbaar met alcohol en hydrofobe inbedmiddel)

• Alternatief: ‘alternatieve’ inbedmiddelen= hydrofobe harsen waarop hydrofiele groepen
zitten en hydrofiele inbedmiddelen MAAR: minder stabiel en inferieure morfologie

3) Snijden
• Ingebed in paraffine (LM)
o Vrij zacht
o Coupes max. 10 m dik (10.10-6m), (doorlaatbaar voor licht)
o Verwarmd tot 55°C: smelt, indringen in weefsel (veel epitopen bewaard)
o Makkelijk uit weefsel weg etsen
o Snijden met microtoom uitgerust met stalen messen
o Coupes op glazen draagglas

• Ingebed in hars, plastics (EM)
o Harder
o Coupes max. 70 nm dik (70.10-9m), (doorlaatbaar voor elektronen)
o Polymerisatie hars: 60-65°C


1

, o Meeste harsen moeilijk uit weefsel weg te etsen
 minder geschikt voor immuunkleuringen
o Snijden met microtoom uitgerust met diamanten/glazen messen
o Coupes op metalen (Cu,Ni) roostertjes = grids

4a) Kleuren (LM)
• LM
o Wit licht: spectrum van golflengtes (kleur)
o Contrast in coupes laag  kleuren
o Kleurstoffen: (vaak) waterige oplossingen
o Coupes worden gedeparaffineerd (tolueen) (‘2e clearing’)

• Routinekleuring (voor LM) = haematoxyline-eosine
o Gebaseerd op aanwezigheid zure (-) en basische (+) bestanddelen
✓ Kern veel zure groepen (DNA, RNA, NISSL stof)
✓ Cytoplasma veel basische groepen (eiwitten met IEP bij basische pH-waarden)
o Kleurstoffen zelf:
✓ Kationische (+) basische kleurstof (H) reageert met zure (-) bestanddelen  blauw
✓ Anionische (-) zure kleurstof (E) reageert met basische (+) bestanddelen  rood/oranje
o Basofiel/eosinofiel:
✓ Basofiel = weefselcomponent reageert met + kleurstof = H  blauw
✓ Eosinofiel = weefselcomponent reageert met – kleurstof = E  rood/oranje
o Toegepast op de cel
✓ Kern > DNA en RNA (- geladen)  H (+, basische kleurstof)  blauw
✓ Cytoplasma > EW bij pH= 6 (+ geladen)  E (-, zure kleurstof)  oranje/rood
(blauwe korreling in cytoplasma  ribosomen > rRNA en ribosomale EW)

• Cytochemie
o Proteïnen (eiwitten)
✓ Polymeren van AZ
✓ Basisstructuur AZ




✓ Zure (COO-) en basische (NH3+) , overmaat afhankelijk van pH en IEP
✓ pH= 6/7: EW vooral + geladen  eosine (oranje)
o Nucleïnezuren (DNA/RNA)
✓ Nucleotide > pentose, base en fosfaatgroep
✓ Neg. lading, vooral in kern  haematoxyline (blauw)
o Koolhydraten (suikers)
✓ Polysacchariden, enk. of samengest.
✓ Metachromasie:
Probleem: suikers lossen op in waterig fixatief  gedeeltelijk verloren bij dehydratatie
Oplossing: stof bij fixatief toevoegen neerslag koolhydraten
Gevolg: kleurbaar met kationische kleurstof (H)  kleuromslag v/d kleurstof (vw: dichte
schikking van – groepen) (gekleurde object krijgt andere kleur dan de gebruikte kleurstof)
Voorkomen: kraakbeen en mastcellen

o Lipiden (vetten)
✓ Vetzuren: Cn H2n+1 COOH
✓ Lossen op in alcohol  niet kleurbaar volgens HE-routine
✓ EM: OsO4 als bijkomend fixatief (grote affiniteit voor vetzuren) (osmium tetroxide)




2

, 4b) Contrasteren (EM)
• EM
o Elektronen w versneld (1 λ)
o Geen kleuren
o λ buiten bereik vd gevoeligheid vh menselijk oog
o contrasteren = verhogen vd densiteitsverschillen dmv zware metalen (<-> HE bij LM)
• OsO4: - reeds bij fixatief
- affiniteit voor membranen (vetten)
• Uranylacetaat: - reageert met fosfaat en aminogroepen
 nucleïnezuren (DNA/RNA) en EW Contrasteringsvloeistof
• Loodcitraat: - reageert met – groepen (uranyl- & loodcitraat)
 nucleïnezuren (DNA/RNA)


 structuren waar metalen opzitten zijn donker
 metalen zorgen vr ‘scatter’ vd elektronen die bijgevolg niet bijdragen tot de beeldvorming

b) Specifieke kleurtechnieken

1) Indifferente kleurstoffen:
 kleuren vetten aan
(vetten moeilijk te kleuren want lossen bij standaardkleuring op in alcoholbaden)
 bv. oil red kleuring (rood)

2) Immunohistochemische kleuring:
 met antilichamen (Ig): herkennen bepaalde EW
 aan Ig: fluorescerend EW of goudpartikel

 Immunocytochemische kleuring
o bv. met DAB
 Immuno- goud kleuring (EM)
o AL met een goudpartikel  EM
o Bv. Ig tegen catalase= anti-catalase hieraan goud hangen, nu kan je peroxisomen (catalase) lokaliseren
 Immunofluorescentie (LM)
o We proberen cel te kleuren maar de cel is gesloten (AL kan enkel op antigenen (AG) vh buitenste
celoppervlakte binden), kan niet door de plasmamembraan diffunderen  gaten maken in membraan
 AL binnenbrengen  interne antigenen detecteren met AL
o AL met fluorochroom (> fluor)  LM
o INDIRECT: je hangt aan je 1e AL een 2e AL met fluorescerend deeltje
o DIRECT: je hangt aan je 1e AL het fluorescerend deeltje
o (bv. met AL tegen GLUT-2 = anti GLUT 2, hiermee GLUT-2 aantonen (fluorochroom aan anti GLUT-2))
 Toepassing muco (cystic fibrosis):
o Mutatie CTFR-gen
o Lokalisatie van dit EW via immunohistochemische kleuring
o CTFR zou apicaal moeten zijn, bij muco zit dit veel meer in de cel
o Gemuteerd CTFR wordt niet meer naar de apicale kant van de cel gebracht, blijft in cytoplasma en wordt
hier snel afgebroken  minder CFTR en niet meer apicaal

3) Enzymkleuringen:
 activiteit enzymen aantonen: gebruik van een voor het enzym specifiek substraat => vorming neerslag

4) Autoradiografie:
 histologische techniek metabolische activiteit visualiseren: radioactief gemerkte precursoren ingebouwd,
coupes maken, contact met fotografische emulsie
 aan weefsel/cel een radioactief AZ hangen EW w radioactief




3