Samenvatting Biotechnologie en maatschappij deeltentamen 1

Biotechnologie tentamen 1

Technieken:
- Agarose gel electroforese
- Southern blotting
- Northern blotting
- Western blotting
- FISH
- Maken van library
o cDNA
o chromosomaal
o vinden van een gen in een bank
 colony blotting
- kloneren in vector
o resistentie tegen antibioticum
o blauw-wit screening
- PCR
- Realtime / quantitatieve PCR (qPCR)
o SYBR Green methode
o Taqman probe
- Sanger sequencen
- Next generation sequencing
- DNA microarray
- RNA interferentie
- SDS-page
o Coomassie blue kleuring
- ELISA
- Upstream processing
- Downstream processing
o Zuiveren
 Size exclusion chromatografie
 Ion exchange chromatografie
 Affiniteits chromatografie
 HPLC High Performance Liquid Chromatografie
o Controleren juiste structuur
 Kristallisatie en Röntgen diffractie
- Protein microarrays
- 2D electroforese en massa spectrometrie
o Isoelectric focussing
o SDS-page
- Identificatie eiwitten
o N-terminaal sequencen door Edman degradatie
o Massa spectrometrie

Mutaties:
- Silent mutatie
- Missense mutatie
- Nonsense mutatie
- Frameshif

,Prokaryoten Eukaryoten
- Geen kern - Kern
- Geen membraan omgeven organellen - Organellen
- Circulair chromosoom - Lineaire chromosome
- Haploid - Histonen
- Plasmiden - DNA + eiwitten = chromatine
- 1 ori per chromosoom - Vaak diploid
- Transcriptie en translatie zijn gekoppeld - Meerdere ori’s per chromosoom
- Promotor is vaak een Pribnow box - Transcriptie in kern, translatie in
- Geen transcriptiefactoren nodig cytoplasma
- Operon structuur - Promoter is een TATA box
- Initiatie van translatie: herkennen Shine - Transcriptiefactoren nodig
Dalgarno door kleine subunit mbv - Processing mRNA
initiatiefactoren. Vervolgens binden - Initiatie van translatie: kleine subunit
tRNA en grote subunit van ribosoom herkent de CAP mbv
initiatiefactoren. Vervolgens verplaatst
het tot het startcodon en binden tRNA
en grote subunit

5’ uiteinde van DNA: fosfaatgroep
3’ uiteinde van DNA: suikergroep

Tussen A en T worden twee waterstofbruggen gevormd, tussen G en C drie.
Centrale dogma: Transcriptie (DNA naar RNA)  Translatie

Monocistronisch: 1 promoter, 1 gen
Polycistronisch: 1 promoter, meerdere genen – operon structuur (alleen in prokaryoten)

Replicatie
- Helicase
- Single strand binding protein
- Primase (RNA primer)
- DNA polymerase 3 5’-> 3’
o Leading strand: continue
o Lagging strand: Okazaki fragmenten
- RNA primers -> DNA (DNA polymerase 1)
- Ligase maakt stukken aan elkaar

De codons zijn universeel, maar de codon preferentie verschilt wel tussen soorten, dit kan invloed
hebben op de efficiëntie waarmee een eiwit in een ander organisme wordt gemaakt.

Basis recombinant DNA technologie
- DNA kan geknipt worden met restrictie-enzymen
- DNA kan geplakt worden met ligase
- DNA kan geïntroduceerd worden in organismen met behulp van vectoren

Restrictie enzymen knippen sticky ends of blunt ends. Met ligase kan het weer aan elkaar gemaakt
worden.
Functie: verbreken vreemd DNA, eigen DNA is gemethyleerd hier tegen.

,Er zijn verschillende vectoren voor het inbrengen van genen
Vector + insert = construct
- Plasmiden
- Bacteriofagen
- Cosmiden
- BAC Bacterial artificial chromosome
- YAC Yeast artificial chromosome

Resistentiegen in vector / plasmide selecteert op cellen die plasmide hebben opgenomen.
Met blauw-wit screening selecteer je de plasmiden die het gen hebben opgenomen.
- Wit: lacZ gen niet intact, dus gen opgenomen
- Blauw: lacZ gen wel intact, gen dus niet opgenomen

Agarose gel electroforese

Scheiding op grootte.
Aan beide kanten van de gel zijn elektrodes. Negatief geladen DNA gaat van min naar plus door de
gel. Grote fragmenten migreren langzamer dan kleine. Gel wordt gekleurd met een stof die bindt aan
DNA, waardoor het DNA onder UV licht zichtbaar wordt.
Het gebruik van een marker is belangrijk voor het bepalen van de grootte van het fragment.

Southern blotting

Doel: aantonen specifiek stuk DNA
Eerst gel-electroforese
Fragment overbrengen op een membraan, complementaire probe toevoegen die gelabeld is. Niet
gebonden probes weg wassen. Wel gebonden probe detecteren, als de probe is gebonden is hier het
specifieke DNA aanwezig waar je naar zocht.

Northern blotting

Aantonen RNA met DNA probe

FISH

Gebruikt om te kijken welk chromosoom het gen van interesse bevat.
Maak een karyotype. Denatureer DNA. Voeg probe toe voor een bepaald gen. Was niet gebonden
probe weg. Kijk waar de probe gebonden heef. Hiermee kunnen genetische afwijkingen opgespoord
worden.

, Maken van een bank

Twee verschillende soorten banken
- Genomic library (chromosomale bank)
o Isoleren chromosomaal DNA
o Knippen in fragmenten
o Inbrengen fragmenten in vectoren
o Inbrengen vectoren in gastheer
- cDNA library
o isoleren mRNA van cellen waar je gewenste gen tot expressie komt
o toevoegen poly T primer (bindt aan poly-A staart)
o complementaire streng DNA maken met reverse transcriptase
o verwijderen RNA streng
o maken van dubbelstrengs DNA met DNA polymerase
o Vaak worden er linkers aan het cDNA gezet, met bepaalde herkenningssites voor
restrictie enzymen zodat deze hetzelfde zijn voor het insert en de vector.
o Vectoren inbrengen in gastheer

Hoe vinden we een gen in een library?
- Probe
o Single stranded DNA (complementair met het gen waarin je geïnteresseerd bent.
o Gelabeld
o Gebaseerd op homoloog gen als het gen in het betreffende organisme nog niet
bekend is.
o Als dit ook niet bekend is dan bepalen we een deel van de aminozuur sequentie
(reverse translation). Vervolgens kijken welke codons kunnen coderen voor deze
aminozuren, hierbij wordt rekening gehouden met de codon preferentie.
o Vaak mengsel van probes bij reverse translation, omdat je niet met zekerheid kan
zeggen welke codons het precies bevat.
- Colony blotting
o Kolonie overbrengen op membraan
o Toevoegen probe
o Afspoelen overige probes
o Zichtbaar maken gebonden probes


PCR

DNA sequentie vermenigvuldigen
Ingrediënten:
- Template DNA
- 2 primers
- Nucleotiden
- Taq polymerase