Les 1 moleculaire microbiologie
Het aantonen van moleculen bij bacteriën is een belangrijke methode geworden,
identificatie. Onder de moderne technieken vallen VITEK en de MALDI-TOF, deze technieken
zijn ook al gebaseerd op moleculaire technieken omdat je biochemische
omzettingen aantoont en dat zijn ook moleculen. De klassieke technieken zijn; morfologie, bacterie
kleuring, groei op kweekmedia of fenotypering (deze technieken kosten alleen veel tijd)
Het eerste wat je moet weten als je een PCR opzet:
Genetische achtergrond en welke specifiek is voor het organisme ofwel de structuur van virus weten
Bij een PCR wil je weten of het virus uit DNA of RNA bestaat, omdat als het uit RNA bestaat je eerst
nog een reverse transcriptase gedaan moet worden en dan kan je kijken naar sequentie voor primers
die specifiek aan het DNA binden
De mijlpalen van de moleculaire technieken:
- James Watson en Francis Crick (1953) Ontrafeling dubbele helixstructuur. De beide
strengen zijn ook naar deze mannen vernoemd: Watson-streng en Crick-streng.
Nobelprijswinnaar van 1962
Roselind Franklin was al overleden en dan is het niet meer mogelijk om de nobelprijs te
ontvangen, en ze werkte met rontgenstraling en heeft ook als eerste een mooi plaatje van
een DNA-molecuul verkregen.
Watson heeft een roman geschreven over hoe alles is verlopen
- Fred Sanger (1975) Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek, is al eerder voorbij
gekomen en is een efficiënte manier om te sequencen, dit is in de loop van de periode wel
doorontwikkeld. Ook is het bekend onder een andere naam: dideoxynucleotiden (ddNTP),
stopt de reactie en kon de gehele sequentie worden verkregen.
Nobelprijswinnaar van 1980
- Kary Mullis (1983) Uitvinding Polymerase Chain Reaction (PCR), is de eerste
wetenschapper die de PCR heft geperfectioneerd waardoor deze cyclisch is geworden. Hier is
de Taq-polymerase (= enzym) ontdekt (deze is afkomstig van de Thermus aquaticus), een
bacterie die is gevonden is een hittebron. Het is een thermostabiel eiwit die ervoor zorgde
dat er naar de 95℃ kon gaan om het DNA te denatureren en vervolgens weer kon afkoelen
en het enzym was nog steeds werkzaam. In het begin moest je na elke cyclus weer nieuwe
enzym erbij doen mocht het een cyclische reactie worden. TaqDNA polymerase heeft geen 3’-
5’ exonucleaseactiviteit (geen proofreading), en hij heeft een snelle synthese (stap van 72℃)
dus let hierbij op de elongatietijd of deze lang genoeg is voor het product dat gemaakt moet
worden.
Nobelprijswinnaar van 1994
- Roche (1992) Eerste commerciële moleculaire tests, het is niet perse Roche die hier de
meest belangrijke schakel in is maar meer alle bedrijven die alles hebben geautomatiseerd en
het is belangrijk voor de kwaliteit van alle testen.
Welke technieken zijn er voor de identificatie van bacteriën:
MALDI-TOF, PCR, Sequencing en Microscopie
Verschil DNA en RNA:
DNA heeft Thymine, deoxyribose als suiker en 2 strengen
RNA heeft Uracil, ribose als suiker en 1 streng
,Bij gebruik van reverse transcriptase is het van belang om het RNA te denatureren (RNA dus splitsen)
en het vervolgens op ijs te plaatsen dan blijft het namelijk lineair als het opwarmt dan komt de oude
structuur weer terug.
Als er wordt gesproken over genen en sequencen is het 16S rDNA gen belangrijk.
Groene gebieden Geconserveerde gebieden, niet te gebruiken voor identificatie (= nodig voor
functie van het eiwit)
Grijze gebieden Variabelen gebieden, wel te gebruiken voor identificatie (= zijn minder belangrijk
voor de functie van het eiwit) door mutaties veranderd
Bij onderzoek naar microbiota wordt er vaak geconcentreerd op het 16S-gen en de variabelen delen.
Soort specifieke genen kunnen ook worden bekeken en dan wordt er gekeken welke genen er bij
welke soorten voorkomen (= virulentie factoren).
Pneumolysine= aantonen van Pneumokokken
Verder kan er ook sprake zijn van familie-specifieke genen, hieronder vallen de huishoud-genen of
resistentiegenen (MecA-PCR). En tegenwoordig is het ook mogelijk om het gehele genoom te
amplificeren (is niet duur en complex meer).
Van DNA naar RNA naar eiwit:
1. Signaal dat RNA-polymerase actief moet gaan worden bij een bepaald gen omdat een eiwit
nodig is.
2. Door een signaal wordt de cascade aangezet
3. Dan krijg je een RNA streng en die verschillende tripletten worden met het tRNA wordt het
een polypeptide molecuul (= eiwit) en dan heeft het zijn functionele vorm.
Heeft kennis en begrip van synthese en structuur van nucleïnezuren:
Opbouw DNA:
- Fosfaatgroep
- Suikergroep
- Base (purine paar met pyrimidine)
Purines: Adenine en Guanine
Pyrimidine: Thymine en Cytosine
A-T 2 waterstofbruggen
C-G 3 waterstofbruggen (hiervoor is een hogere smelttemperatuur nodig dan voor een A-T
rijk gebied
Waterstofbruggen zorgen voor stabilisatie tussen de basen en kunnen dus verbroken worden door
het DNA te verhitten
Kan de verschillende componenten van een PCR-mix benoemen:
PCR heeft 4 verschillende ruimtes:
1. Schone ruimte hier liggen primers, probes en zullen de mixen gemaakt worden
2. Vieze ruimte laboratorium hier wordt het DNA/RNA toegevoegd aan de mixen
3. PCR-ruimte ruimte waar de PCR apparaten staat en wordt uitgevoerd
4. Gel-elektroforese ruimte waar zo nodig een gel wordt gerund pas in deze ruimte worden
de epjes opengemaakt om contaminaties in PCR-ruimtes te voorkomen
In deze ruimtes geldt een eenrichtingsverkeer. Ook moet er DNA/RNA aanwezig zijn en de sequentie
bekend zijn aangezien er anders geen primers ontwikkeld kunnen worden
, Alles wat nodig is;
- Target DNA
- dNTP’s (4 soorten, 20-200 µM) te hoge concentraties leidt tot systeemfouten
- PCR-buffer
- Taq-DNA-polymerase
- MgCl2 co-factor voor Taq en heeft een stabiliserend effect
- Primers
Remmers van polymerase:
Ureum, SDS, hoge zoutconcentraties, DMSO, urinecomponenten, heprine, proteolytische enzymen
Herkent sense en anti-sense sequenties:
Sense enkel strengs DNA (ookwel positief DNA) als RNA van dezelfde sequentie wordt vertaald of
kan worden omgezet naar een eiwit
Anti-sense complementaire streng van de sense-streng
Kent voorwaarden waar een primer/ probe aan moet voldoen en welke factoren van belang zijn bij
het ontwerpen van de primers/ probes
Primers:
- Tussen 18-25 nucleotiden lang (zorgt voor specifieke binding)
- Primerpaar moet een CG-gehalte van 40-70% hebben (hoe meer CG’s
hoe hoger annealingtemperatuur)
- Primerpaar moet ongeveer dezelfde annealingtemperatuur hebben
- Geen baseparing in primer zelf of tussen primers (zodra loop of
hairpins worden gevormd mag dit niet gebruikt worden als
primerpaar)
- Grootte PCR-product moet 75-200 bp zijn (geeft hoogste efficientie)
- Smeltemperartuur (Tm) 50-60 graden
Tm is temperatuur waarbij de helft van het DNA nog dubbelstrengs is en de
helft van de primer maar mee kan doen. Deze temperatuur wordt vaak 5-10
graden onder die van de primer gezet, anders bindt de helft van de primer
niet
Probes:
- Moet eerder binden aan DNA dan primers maar hij moet ook tussen primers binden. Als
primers een hogere Tm hebben dan de probes dan zullen ze eerder binden dan de probe
waardoor polymerase al begint aan de elongatie. Hierdoor krijg je gaan signaal terwijl er wel
amplificatie plaatsvindt
- GC-gehalte 20-80%
- Geen lange herhalingen van nucleotiden (GGGG). Probe moet binden aan de goede plek op
template, hoe langer die stretch is op des te meer plekken die kan binden.
- Geen G’s aan 5’ kant (hierdoor kan extra quenching optreden)
- Meer C’s dan G’s
Probe wordt gebruikt om te weten of een bepaald stukje DNA/RNA is geamplificeerd
Het aantonen van moleculen bij bacteriën is een belangrijke methode geworden,
identificatie. Onder de moderne technieken vallen VITEK en de MALDI-TOF, deze technieken
zijn ook al gebaseerd op moleculaire technieken omdat je biochemische
omzettingen aantoont en dat zijn ook moleculen. De klassieke technieken zijn; morfologie, bacterie
kleuring, groei op kweekmedia of fenotypering (deze technieken kosten alleen veel tijd)
Het eerste wat je moet weten als je een PCR opzet:
Genetische achtergrond en welke specifiek is voor het organisme ofwel de structuur van virus weten
Bij een PCR wil je weten of het virus uit DNA of RNA bestaat, omdat als het uit RNA bestaat je eerst
nog een reverse transcriptase gedaan moet worden en dan kan je kijken naar sequentie voor primers
die specifiek aan het DNA binden
De mijlpalen van de moleculaire technieken:
- James Watson en Francis Crick (1953) Ontrafeling dubbele helixstructuur. De beide
strengen zijn ook naar deze mannen vernoemd: Watson-streng en Crick-streng.
Nobelprijswinnaar van 1962
Roselind Franklin was al overleden en dan is het niet meer mogelijk om de nobelprijs te
ontvangen, en ze werkte met rontgenstraling en heeft ook als eerste een mooi plaatje van
een DNA-molecuul verkregen.
Watson heeft een roman geschreven over hoe alles is verlopen
- Fred Sanger (1975) Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek, is al eerder voorbij
gekomen en is een efficiënte manier om te sequencen, dit is in de loop van de periode wel
doorontwikkeld. Ook is het bekend onder een andere naam: dideoxynucleotiden (ddNTP),
stopt de reactie en kon de gehele sequentie worden verkregen.
Nobelprijswinnaar van 1980
- Kary Mullis (1983) Uitvinding Polymerase Chain Reaction (PCR), is de eerste
wetenschapper die de PCR heft geperfectioneerd waardoor deze cyclisch is geworden. Hier is
de Taq-polymerase (= enzym) ontdekt (deze is afkomstig van de Thermus aquaticus), een
bacterie die is gevonden is een hittebron. Het is een thermostabiel eiwit die ervoor zorgde
dat er naar de 95℃ kon gaan om het DNA te denatureren en vervolgens weer kon afkoelen
en het enzym was nog steeds werkzaam. In het begin moest je na elke cyclus weer nieuwe
enzym erbij doen mocht het een cyclische reactie worden. TaqDNA polymerase heeft geen 3’-
5’ exonucleaseactiviteit (geen proofreading), en hij heeft een snelle synthese (stap van 72℃)
dus let hierbij op de elongatietijd of deze lang genoeg is voor het product dat gemaakt moet
worden.
Nobelprijswinnaar van 1994
- Roche (1992) Eerste commerciële moleculaire tests, het is niet perse Roche die hier de
meest belangrijke schakel in is maar meer alle bedrijven die alles hebben geautomatiseerd en
het is belangrijk voor de kwaliteit van alle testen.
Welke technieken zijn er voor de identificatie van bacteriën:
MALDI-TOF, PCR, Sequencing en Microscopie
Verschil DNA en RNA:
DNA heeft Thymine, deoxyribose als suiker en 2 strengen
RNA heeft Uracil, ribose als suiker en 1 streng
,Bij gebruik van reverse transcriptase is het van belang om het RNA te denatureren (RNA dus splitsen)
en het vervolgens op ijs te plaatsen dan blijft het namelijk lineair als het opwarmt dan komt de oude
structuur weer terug.
Als er wordt gesproken over genen en sequencen is het 16S rDNA gen belangrijk.
Groene gebieden Geconserveerde gebieden, niet te gebruiken voor identificatie (= nodig voor
functie van het eiwit)
Grijze gebieden Variabelen gebieden, wel te gebruiken voor identificatie (= zijn minder belangrijk
voor de functie van het eiwit) door mutaties veranderd
Bij onderzoek naar microbiota wordt er vaak geconcentreerd op het 16S-gen en de variabelen delen.
Soort specifieke genen kunnen ook worden bekeken en dan wordt er gekeken welke genen er bij
welke soorten voorkomen (= virulentie factoren).
Pneumolysine= aantonen van Pneumokokken
Verder kan er ook sprake zijn van familie-specifieke genen, hieronder vallen de huishoud-genen of
resistentiegenen (MecA-PCR). En tegenwoordig is het ook mogelijk om het gehele genoom te
amplificeren (is niet duur en complex meer).
Van DNA naar RNA naar eiwit:
1. Signaal dat RNA-polymerase actief moet gaan worden bij een bepaald gen omdat een eiwit
nodig is.
2. Door een signaal wordt de cascade aangezet
3. Dan krijg je een RNA streng en die verschillende tripletten worden met het tRNA wordt het
een polypeptide molecuul (= eiwit) en dan heeft het zijn functionele vorm.
Heeft kennis en begrip van synthese en structuur van nucleïnezuren:
Opbouw DNA:
- Fosfaatgroep
- Suikergroep
- Base (purine paar met pyrimidine)
Purines: Adenine en Guanine
Pyrimidine: Thymine en Cytosine
A-T 2 waterstofbruggen
C-G 3 waterstofbruggen (hiervoor is een hogere smelttemperatuur nodig dan voor een A-T
rijk gebied
Waterstofbruggen zorgen voor stabilisatie tussen de basen en kunnen dus verbroken worden door
het DNA te verhitten
Kan de verschillende componenten van een PCR-mix benoemen:
PCR heeft 4 verschillende ruimtes:
1. Schone ruimte hier liggen primers, probes en zullen de mixen gemaakt worden
2. Vieze ruimte laboratorium hier wordt het DNA/RNA toegevoegd aan de mixen
3. PCR-ruimte ruimte waar de PCR apparaten staat en wordt uitgevoerd
4. Gel-elektroforese ruimte waar zo nodig een gel wordt gerund pas in deze ruimte worden
de epjes opengemaakt om contaminaties in PCR-ruimtes te voorkomen
In deze ruimtes geldt een eenrichtingsverkeer. Ook moet er DNA/RNA aanwezig zijn en de sequentie
bekend zijn aangezien er anders geen primers ontwikkeld kunnen worden
, Alles wat nodig is;
- Target DNA
- dNTP’s (4 soorten, 20-200 µM) te hoge concentraties leidt tot systeemfouten
- PCR-buffer
- Taq-DNA-polymerase
- MgCl2 co-factor voor Taq en heeft een stabiliserend effect
- Primers
Remmers van polymerase:
Ureum, SDS, hoge zoutconcentraties, DMSO, urinecomponenten, heprine, proteolytische enzymen
Herkent sense en anti-sense sequenties:
Sense enkel strengs DNA (ookwel positief DNA) als RNA van dezelfde sequentie wordt vertaald of
kan worden omgezet naar een eiwit
Anti-sense complementaire streng van de sense-streng
Kent voorwaarden waar een primer/ probe aan moet voldoen en welke factoren van belang zijn bij
het ontwerpen van de primers/ probes
Primers:
- Tussen 18-25 nucleotiden lang (zorgt voor specifieke binding)
- Primerpaar moet een CG-gehalte van 40-70% hebben (hoe meer CG’s
hoe hoger annealingtemperatuur)
- Primerpaar moet ongeveer dezelfde annealingtemperatuur hebben
- Geen baseparing in primer zelf of tussen primers (zodra loop of
hairpins worden gevormd mag dit niet gebruikt worden als
primerpaar)
- Grootte PCR-product moet 75-200 bp zijn (geeft hoogste efficientie)
- Smeltemperartuur (Tm) 50-60 graden
Tm is temperatuur waarbij de helft van het DNA nog dubbelstrengs is en de
helft van de primer maar mee kan doen. Deze temperatuur wordt vaak 5-10
graden onder die van de primer gezet, anders bindt de helft van de primer
niet
Probes:
- Moet eerder binden aan DNA dan primers maar hij moet ook tussen primers binden. Als
primers een hogere Tm hebben dan de probes dan zullen ze eerder binden dan de probe
waardoor polymerase al begint aan de elongatie. Hierdoor krijg je gaan signaal terwijl er wel
amplificatie plaatsvindt
- GC-gehalte 20-80%
- Geen lange herhalingen van nucleotiden (GGGG). Probe moet binden aan de goede plek op
template, hoe langer die stretch is op des te meer plekken die kan binden.
- Geen G’s aan 5’ kant (hierdoor kan extra quenching optreden)
- Meer C’s dan G’s
Probe wordt gebruikt om te weten of een bepaald stukje DNA/RNA is geamplificeerd
