Massa Spectrometrie Deel 2
HC 10
Het gebruik van natve massaspectrometrie benadering is om eiwit structuur en interactes te bestuderen.
Structurele biologie is de studie van driedimensionale structuren van biologische moleculen. Eiwit
structuur en functe zijn gerelateerd aan elkaar.
Proteomics (identicate van eiwitenncomplexen) Natve MS (karakterisering van eiwitenncomplexen)
Hoge resolute technieken (NMR, X-Ray kristallograie, structuren van eiwitenncomplexen).
Uit het MW van eiwiten kunnen PTMs bepaald worden, maar ook individuele subunits en
eiwitcomplexen. Uit het eiwitcomplex kan weer de stoichiometrie gehaald worden. Met het intacte eiwit
kunnen ook eiwit-eiwit interactes gemeten worden of eiwit-ligand interactes (substraat, drugs, …).
Hieruit kan weer de relateve sterkte van interactes bepaald worden. Het intacte eiwit geef informate
over de structuur (grootenvorm, dynamica, oppervlak) en conformate (gevouwen, gedenatureerd, …). Bij
natve massaspectrometrie wordt ES2 gebruikt voor sample ionisate en TOF of Orbitrap analysatoren voor
massa bepalingen.
Bij ES2 worden moleculen in oplossing door een klein
capillair gespoten, waarover een voltage staat. Door het
voltage komt de vloeistof vanzelf uit het capillair. De
oppervlaktespanning van de druppel beïnvloed de
verdamping en Taylor Cone formate. Methanol is vluchtger
dan water en heef een lagere oppervlaktespanning. 2n het
geval van kleine metabolieten scheiden zich kleinere
druppeltjes af van de grote druppel met de metaboliet. Bij
grotere eiwiten, verdampen juist de watermoleculen en
blijven de protonen en het eiwit over. Er zijn dus twee
modellen: het ‘2on Evaporaton Model’ (2EM) voor kleine
ionen, en het ‘Charge Residue Model’ (CRM) voor grote
ionen. Bij het CRM ondergaat een druppel stabiele
oplosmiddel verdamping totdat de Rayleigh limiet wordt
bereikt, waarbij de ladingsdichtheid de oppervlaktespanning overtref en de druppel scheidt. Dit gaat
door totdat de druppel nog maar een enkel eiwitmolecuul bevat. ES2 is zeer geschikt omdat (i) het een
mild proces is en (ii) omdat het ionen met meerdere ladingen vormt (grote moleculen bij lage mnz).
Daarnaast is voor nano-ES2 maar weinig sample volume nodig. Gevouwen eiwiten krijgen minder
ladingen dan ongevouwen eiwiten omdat zijketens minder beschikbaar zijn.
- 2onisate efcicnte is vrij onanankelijk van ion karakteristeken.
- De lading van gevouwen eiwiten correspondeert vaak met de maximale lading van de
oplosmiddel druppels met dezelfde groote als het molecuul bij de Rayleigh limiet.
Condites van ES2:
- Eiwit samples
o Concentrate: 0,1-50 µM
o Hoge zuiverheid (>90%)
- Oplosmiddel condites
o Mengsel van acetonitrile en water of methanol en water (lagere oppervlaktespanning en
na LC)
o pH 2 met azijnzuur of formic acid (veel protonen voor lading)
1
, o Liefst compatble met LC
o Eiwiten moeten oplosbaar zijn
o Flows in de regio van 1 µl tot 1 mL per minuut
Vaak worden TOF-analysatoren gecombineerd met een quadrupel zodat tandem MS mogelijk is. TOF-
analysatoren hebben een ongelimiteerde massarange en zijn dus zeer geschikt. Door aanpassingen van de
quadrupel kunnen ook grotere macromoleculaire complexen gemeten worden. Orbitrap werd vooral
gebruikt voor analyse van kleine peptden, maar een voordeel is wel het toegenomen oplossend
vermogen.
Gedrag van grote moleculen: een molecuul kan niet
hoger geladen worden dan het aantal beschikbare
lading-accepterende sites. De lading van grote
gevouwen moleculen correspondeert vaak met de
lading van de oplosmiddel druppels van dezelfde
groote. Voor minder grote gevouwen eiwiten is de
lading staat vaak lager: de lading is gelimiteerd door
lading drager emissie voor complete oplossing. De
lading van ongevouwen eiwiten is vaak hoger =
supercharging.
2n positeve ion modus kunnen basische aminozuren
gemakkelijk geprotoneerd worden. Dit geldt ook voor de N-terminus. Eiwiten kunnen dus geprotoneerd
worden op meerdere plekken. Waarom krijgen eiwiten niet één bepaalde lading staat maar een
ladingsverdeling? Dit heef te maken met de protonafniteit van de basische aminozuren, en dat is weer
anankelijk van de plaats van het residu in het eiwit.
Wanneer er meerdere eiwiten in één druppel ziten, ontstaat er concurrente over welke eiwit
geïoniseerd wordt (suppressie-efect). De intensiteit van het ion neemt toe met de concentrate, maar tot
een bepaalde hoogte want daarna vlakt het af en daalt de intensiteit zelfs. Een hydrofoob eiwit ioniseert
sneller dan een minder hydrofoob eiwit. Hierdoor is massaspectrometrie niet zo’n goede kwanticate
methode. Verzadiging- en suppressie efecten zijn minder nadrukkelijk wanneer met zeer lage fow rates
wordt gewerkt (nano-elektrospray).
Condites Natve MS:
- Eiwit samples:
o Concentrate: 0,1-50 uM
o Hoge zuiverheid (>90%)
o Tags, PTMs – kunnen een nadeel zijn door toegenomen heterogeniteit
- Oplosmiddel condites:
o Waterig ammonium acetaat
o Detergenta- alleen lage concentrates
o Bufer zouten – vluchtg (zoals ammonium acetaatnbicarbonaat)
o Niet-vluchtge zoutennmetaal ionen < 1 mM
o pH (vrijwel neutraal)
- Oplosmiddel fow:
o Hoe lager hoe beter, nanoL per min
2s eiwit nog steeds natve in oplossing? Dit kan gezien worden met UV-V2S of met een actviteit assay.
Analyse van geladen staten kan door het ploten van Gaussian curves. Hierdoor kunnen co-bevolkte
conformates onthuld en gekwanticeerd worden. Hoe lager de pH, hoe meer het eiwit ontvouwt en hoe
meer ladingen.
2
HC 10
Het gebruik van natve massaspectrometrie benadering is om eiwit structuur en interactes te bestuderen.
Structurele biologie is de studie van driedimensionale structuren van biologische moleculen. Eiwit
structuur en functe zijn gerelateerd aan elkaar.
Proteomics (identicate van eiwitenncomplexen) Natve MS (karakterisering van eiwitenncomplexen)
Hoge resolute technieken (NMR, X-Ray kristallograie, structuren van eiwitenncomplexen).
Uit het MW van eiwiten kunnen PTMs bepaald worden, maar ook individuele subunits en
eiwitcomplexen. Uit het eiwitcomplex kan weer de stoichiometrie gehaald worden. Met het intacte eiwit
kunnen ook eiwit-eiwit interactes gemeten worden of eiwit-ligand interactes (substraat, drugs, …).
Hieruit kan weer de relateve sterkte van interactes bepaald worden. Het intacte eiwit geef informate
over de structuur (grootenvorm, dynamica, oppervlak) en conformate (gevouwen, gedenatureerd, …). Bij
natve massaspectrometrie wordt ES2 gebruikt voor sample ionisate en TOF of Orbitrap analysatoren voor
massa bepalingen.
Bij ES2 worden moleculen in oplossing door een klein
capillair gespoten, waarover een voltage staat. Door het
voltage komt de vloeistof vanzelf uit het capillair. De
oppervlaktespanning van de druppel beïnvloed de
verdamping en Taylor Cone formate. Methanol is vluchtger
dan water en heef een lagere oppervlaktespanning. 2n het
geval van kleine metabolieten scheiden zich kleinere
druppeltjes af van de grote druppel met de metaboliet. Bij
grotere eiwiten, verdampen juist de watermoleculen en
blijven de protonen en het eiwit over. Er zijn dus twee
modellen: het ‘2on Evaporaton Model’ (2EM) voor kleine
ionen, en het ‘Charge Residue Model’ (CRM) voor grote
ionen. Bij het CRM ondergaat een druppel stabiele
oplosmiddel verdamping totdat de Rayleigh limiet wordt
bereikt, waarbij de ladingsdichtheid de oppervlaktespanning overtref en de druppel scheidt. Dit gaat
door totdat de druppel nog maar een enkel eiwitmolecuul bevat. ES2 is zeer geschikt omdat (i) het een
mild proces is en (ii) omdat het ionen met meerdere ladingen vormt (grote moleculen bij lage mnz).
Daarnaast is voor nano-ES2 maar weinig sample volume nodig. Gevouwen eiwiten krijgen minder
ladingen dan ongevouwen eiwiten omdat zijketens minder beschikbaar zijn.
- 2onisate efcicnte is vrij onanankelijk van ion karakteristeken.
- De lading van gevouwen eiwiten correspondeert vaak met de maximale lading van de
oplosmiddel druppels met dezelfde groote als het molecuul bij de Rayleigh limiet.
Condites van ES2:
- Eiwit samples
o Concentrate: 0,1-50 µM
o Hoge zuiverheid (>90%)
- Oplosmiddel condites
o Mengsel van acetonitrile en water of methanol en water (lagere oppervlaktespanning en
na LC)
o pH 2 met azijnzuur of formic acid (veel protonen voor lading)
1
, o Liefst compatble met LC
o Eiwiten moeten oplosbaar zijn
o Flows in de regio van 1 µl tot 1 mL per minuut
Vaak worden TOF-analysatoren gecombineerd met een quadrupel zodat tandem MS mogelijk is. TOF-
analysatoren hebben een ongelimiteerde massarange en zijn dus zeer geschikt. Door aanpassingen van de
quadrupel kunnen ook grotere macromoleculaire complexen gemeten worden. Orbitrap werd vooral
gebruikt voor analyse van kleine peptden, maar een voordeel is wel het toegenomen oplossend
vermogen.
Gedrag van grote moleculen: een molecuul kan niet
hoger geladen worden dan het aantal beschikbare
lading-accepterende sites. De lading van grote
gevouwen moleculen correspondeert vaak met de
lading van de oplosmiddel druppels van dezelfde
groote. Voor minder grote gevouwen eiwiten is de
lading staat vaak lager: de lading is gelimiteerd door
lading drager emissie voor complete oplossing. De
lading van ongevouwen eiwiten is vaak hoger =
supercharging.
2n positeve ion modus kunnen basische aminozuren
gemakkelijk geprotoneerd worden. Dit geldt ook voor de N-terminus. Eiwiten kunnen dus geprotoneerd
worden op meerdere plekken. Waarom krijgen eiwiten niet één bepaalde lading staat maar een
ladingsverdeling? Dit heef te maken met de protonafniteit van de basische aminozuren, en dat is weer
anankelijk van de plaats van het residu in het eiwit.
Wanneer er meerdere eiwiten in één druppel ziten, ontstaat er concurrente over welke eiwit
geïoniseerd wordt (suppressie-efect). De intensiteit van het ion neemt toe met de concentrate, maar tot
een bepaalde hoogte want daarna vlakt het af en daalt de intensiteit zelfs. Een hydrofoob eiwit ioniseert
sneller dan een minder hydrofoob eiwit. Hierdoor is massaspectrometrie niet zo’n goede kwanticate
methode. Verzadiging- en suppressie efecten zijn minder nadrukkelijk wanneer met zeer lage fow rates
wordt gewerkt (nano-elektrospray).
Condites Natve MS:
- Eiwit samples:
o Concentrate: 0,1-50 uM
o Hoge zuiverheid (>90%)
o Tags, PTMs – kunnen een nadeel zijn door toegenomen heterogeniteit
- Oplosmiddel condites:
o Waterig ammonium acetaat
o Detergenta- alleen lage concentrates
o Bufer zouten – vluchtg (zoals ammonium acetaatnbicarbonaat)
o Niet-vluchtge zoutennmetaal ionen < 1 mM
o pH (vrijwel neutraal)
- Oplosmiddel fow:
o Hoe lager hoe beter, nanoL per min
2s eiwit nog steeds natve in oplossing? Dit kan gezien worden met UV-V2S of met een actviteit assay.
Analyse van geladen staten kan door het ploten van Gaussian curves. Hierdoor kunnen co-bevolkte
conformates onthuld en gekwanticeerd worden. Hoe lager de pH, hoe meer het eiwit ontvouwt en hoe
meer ladingen.
2
