MGOT Deeltoets 1 (hoorcolleges en practica)
Hoorcolleges
HC 2 – BACTERIAL GENETIC EXCHANGE
Genetische elementen:
- Chromosoom: circulair bij prokaryoten en lineair bij eukaryoten
- Plasmiden = relatief klein circulair DNA, makkelijk overdraagbaar tussen verschillende soorten of
binnen een soort tussen individuen. Het is tussen de 1 en 100 bp groot. Komt weinig voor bij
eukaryoten (sommige protisten en schimmels).
- Virale genomen: DNA of RNA en parasitair. Kunnen in het genoom integreren.
- Transposons: springen normaliter alleen binnen het DNA van een eigen organisme. Het zijn dus
mobiele genetische DNA-elementen.
- Organellen (mitochondriën/chloroplasten) hebben eigen genetische materiaal (circulair).
Prokaryoten vs. eukaryoten:
Chromosoom replicatie verschillen:
- Eukaryoten: heeft splicing en intronen in de genen. Moeten eruit gehaald worden voordat het mRNA
gemaakt wordt om te exporteren. Komt niet voor in prokaryoten. Hierbij zijn de coderende genen niet
onderbroken door intronen.
- Prokaryote chromosoom heeft 1 ORI = ORI C. Hier begint de replicatie. Vanaf hier gaan 2
replicatievorken over het circulaire DNA en komen uiteindelijk aan de terminatiekant (andere kant van
het chromosoom) bij elkaar. Als de ene replicatievork eerder hier is dan de andere, dan wacht de
eerste replicatievork. ORI’s zijn niet gesynchroniseerd, sommige delen lopen voor op de replicatie.
- Eukaryote chromosomen: meerdere ORI’s (replicatie versneld). Plek waar replicatievorken
samenkomen wordt geligeerd en weer correct gemaakt. Deze ORI’s zijn gesynchroniseerd doordat
eukaryote chromosomen ingepakt zitten in nucleosomen.
- Replicatie bij eukaryoten vindt ook maar 1x per celcyclus plaats. Bij prokaryoten kunnen meerdere
replicatierondes gelijktijdig plaatsvinden.
Verschillen in segregatie en transcriptie:
- Prokaryoten: delen die gerepliceerd zijn komen in de dochterdelen terecht, pas als alles gerepliceerd is
kunnen de twee dochtercellen delen.
- Eukaryoten: eerst mitose en dan meiose.
- Prokaryoten: replicatiesnelheid is ongeveer 10x zo snel dan bij eukaryoten. Daardoor is de snelheid
van DNA-polymerase sneller dan die van RNA-polymerase (verhouding 10:1). Oplossing prokaryoten:
transcriptie vindt in dezelfde richting plaats als replicatie.
- Controle van genexpressie: wordt geregeld door promotor. Bij eukaryoten heeft ieder gen eigen
promotor. Bij prokaryoten: genen zijn georganiseerd in operons.
Bacteriële nucleoïd: hier vindt replicatie en expressie plaats. Nucleoïd = DNA met wat eiwitten. Genen die tot
expressie komen zitten in minder compacte gebieden. DNA zit gevouwen als supertwisting.
In eukaryoten zitten alle DNA in nucleosomen verpakt.
Lac-operon:
- Gebruik van lactose als suikerbron.
- 1 promotor waar transcriptiefactoren aan binden.
- Operator = waar repressor aan bindt.
- Gen zit vóór lac-operon à codeert voor repressor waardoor gen niet tot expressie komt bij voldoende
suiker (glucose). Geen glucose maar wel lactose à genexpressie door binding van allolactose aan
repressor. Er wordt dan 1 mRNA gemaakt waaruit 3 eiwitten worden gemaakt.
Plasmiden = extrachromosomaal DNA in bacteriën (behoren niet tot core chromosomen van de cel)
- Circulair, maar in sommige organismen lineair
- Bevatten meestal niet-essentiële genen (dus bacterie kan zonder plasmide leven), maar zitten nuttige
eigenschappen op om in andere omgevingen goed te kunnen groeien, bv.:
1
, o Resistentie tegen antibiotica van bijv. andere organismen in de bodem om andere
organismen weg te kunnen concurreren.
o Afbraak van bijv. tolueen
o Pathogeniciteit
o Symbiose
è Vergroot aanpassingsvermogen van bacteriën en doordat het makkelijk overdraagbaar is kan evolutie
worden bevorderd.
Eigenschappen van plasmiden:
- Replicatie van plasmiden gebeurt onafhankelijk van het chromosoom
o Eigen ORI waarin ook de eiwitten zitten die noodzakelijk zijn voor de initiatie van replicatie.
ORI bepaalt ook in hoeveel kopieën het plasmide aanwezig is. Als er een bepaalde
hoeveelheid van het plasmide aanwezig is dan accumuleert een repressor waardoor de
replicatie stopt.
- ORI vaak bepalend voor:
o Compatibiliteit: als een ander plasmide dezelfde ORI heeft dan zal er maar 1 van de 2
succesvol zijn, de ander gaat verloren.
o Host range
o Copy number
§ Single copy: replicatie lijkt op die van chromosoom en repliceert gelijktijdig met
chromosoom, 1 replicatie per celcyclus, gecontroleerde segregatie over
dochtercellen.
§ Multiple copy (kleinere plasmiden): meerdere replicaties per celcyclus, vaak een
karakteristiek aantal (bv 10-20/cel), segregatie verloopt random (niet gereguleerd).
Voorbeeld: ColE1 plasmide
- 2 RNA-moleculen
- ROP eiwit en RNAI reguleren RNAII functie à reguleren de initiatie van replicatie. Gaat als volgt:
o Stel er is weinig plasmide aanwezig, dan moet het gerepliceerd worden. Dan wordt RNAII
gevormd en die wordt geknipt in de buurt van de ORI. Dan heb je een kleine RNA primer die
wordt gebruikt door DNA-polymerase om een complementaire streng van het plasmide te
maken.
o Voldoende plasmide: veel RNAI productie = anti-sense RNA van RNAII
(complementair aan elkaar). Als die aan elkaar binden dan functioneert RNAII
niet meer goed. Remming door RNAI wordt versneld door ROP eiwit.
Plasmide partitionering:
- Passieve segregatie bij high copy plasmiden (of via killer/antidote). Killer/antidote
principe: selecteren op het behouden van het plasmiden. Killer/antidote ligt op
plasmide. Als plasmide aanwezig is maakt het een toxine en een antidote (= tegengif, om
zichzelf te beschermen).
- Stel dat bacterie riskeert om plasmide te verliezen: antistof is minder stabiel dan toxine
à toxine blijft over en bacterie sterft. Plasmide zorgt er dus voor dat het behouden blijft
à selectie op behoud van plasmide.
- Bij single copy plasmiden wordt segregatie geholpen door par genen (vergelijkbaar met
centromeer).
DNA coiling:
- Enzymen om supercoiling te krijgen. 1 manier om het te krijgen is door een enkelstrengs breuk te
maken. Hierdoor gaat er 1 streng los en deze gaat een aantal keren om de andere streng heen
wikkelen. Vervolgens worden de strengen weer geligeerd à supercoiling.
- Circulaire DNA gebruiken topoisomerase à dubbelstrengs breuk maken, om een andere streng heen
en daarna weer ligeren.
2
, DNA gelelektroforese:
- DNA is negatief geladen dus gaat naar de + pool
- Agarose vormt een netwerk (zeef effect) à kleine fragmenten gaan snel en grote langzaam
- Kleuring met ethidium bromide (EtBr) en vervolgens te zien door UV-belichting
o Gaat tussen de basenparen van het DNA zitten
o Kleurt vooral dubbelstrengs DNA goed
- Uitzetten in een grafiek: afstand die de band gemigreerd heeft tegen het molecuulgewicht
(grootte in bp), dan krijg je een niet-lineaire grafiek. Maar als je log10 neemt van de
fragmentgrootte krijg je een lineaire grafiek.
Mobiliteit van plasmide DNA:
- Topologie van DNA bepaalt de mobiliteit in de gel.
o Supercoiled is compact en klein en loopt dus snel door de gel heen
o Lineaire DNA zit tussen een nicked DNA in en supercoiled DNA
- EtBr beïnvloedt de topologie en dus de mobiliteit
Mechanismen van genetische uitwisseling:
- Conjugatie = overdracht van plasmide DNA tussen 2 bacteriën. Gaat via een conjugatiebuis (F-pili). F-
pili brengt de 2 bacteriën bij elkaar waarna ze DNA kunnen uitwisselen.
o Bijv. als het F-plasmide wordt overgedragen d.m.v. conjugatie dan wordt er een nik gemaakt
op de origin van de conjugatie = oriT. Hier start DNA-polymerase, maakt een nieuwe kopie en
die verplaatst de andere streng. De streng die dan vrijkomt wordt overgebracht via conjugatie
naar de andere cel.
o F-plasmide heeft een 33kb regio met ongeveer 40 genen, hierin ligt ook de oriT. TraA codeert
voor de pilin subeenheid.
§ Surface exclusion: als een bacterie al een eigen plasmide heeft, zal het niet binden
aan de pili à geen DNA overdracht.
o Het F-plasmide kan integreren in het genoom. Het wordt dan een episoom genoemd.
o Hele bacteriële genomen kunnen overgedragen worden door de geïntegreerde F-episoom.
o Sommige plasmiden zijn non-self transmissible
§ Ze hebben een oriT
§ Afhankelijk van andere plasmide voor de tra functie
o Belangrijke rol in bacteriële evolutie
- Transductie gaat d.m.v. een faag. Faag lambda heeft lineair DNA, maar als het in de bacterie komt
wordt het circulair en kan het gaan repliceren.
o Lysogene cyclus: infectie door faag: DNA wordt geïnjecteerd en wordt circulair. Faag DNA
integreert in het genoom en dan repliceert het gewoon mee met celdeling etc.
o Lytische cyclus: faag DNA integreert niet in het genoom, maar repliceert zelf. Er worden
nieuwe eiwitten gevormd voor nieuwe faagdeeltjes. Als de cel vol zit met faagdeeltjes is er
een actief proces waarmee de cel wordt gelyseerd à faag deeltjes komen vrij.
§ Soms verpakt faag ook stukje E. coli DNA. Als deze dan weer een andere bacterie
gaat infecteren, kan er door recombinatie een bepaalde eigenschap worden
uitgewisseld.
3
Hoorcolleges
HC 2 – BACTERIAL GENETIC EXCHANGE
Genetische elementen:
- Chromosoom: circulair bij prokaryoten en lineair bij eukaryoten
- Plasmiden = relatief klein circulair DNA, makkelijk overdraagbaar tussen verschillende soorten of
binnen een soort tussen individuen. Het is tussen de 1 en 100 bp groot. Komt weinig voor bij
eukaryoten (sommige protisten en schimmels).
- Virale genomen: DNA of RNA en parasitair. Kunnen in het genoom integreren.
- Transposons: springen normaliter alleen binnen het DNA van een eigen organisme. Het zijn dus
mobiele genetische DNA-elementen.
- Organellen (mitochondriën/chloroplasten) hebben eigen genetische materiaal (circulair).
Prokaryoten vs. eukaryoten:
Chromosoom replicatie verschillen:
- Eukaryoten: heeft splicing en intronen in de genen. Moeten eruit gehaald worden voordat het mRNA
gemaakt wordt om te exporteren. Komt niet voor in prokaryoten. Hierbij zijn de coderende genen niet
onderbroken door intronen.
- Prokaryote chromosoom heeft 1 ORI = ORI C. Hier begint de replicatie. Vanaf hier gaan 2
replicatievorken over het circulaire DNA en komen uiteindelijk aan de terminatiekant (andere kant van
het chromosoom) bij elkaar. Als de ene replicatievork eerder hier is dan de andere, dan wacht de
eerste replicatievork. ORI’s zijn niet gesynchroniseerd, sommige delen lopen voor op de replicatie.
- Eukaryote chromosomen: meerdere ORI’s (replicatie versneld). Plek waar replicatievorken
samenkomen wordt geligeerd en weer correct gemaakt. Deze ORI’s zijn gesynchroniseerd doordat
eukaryote chromosomen ingepakt zitten in nucleosomen.
- Replicatie bij eukaryoten vindt ook maar 1x per celcyclus plaats. Bij prokaryoten kunnen meerdere
replicatierondes gelijktijdig plaatsvinden.
Verschillen in segregatie en transcriptie:
- Prokaryoten: delen die gerepliceerd zijn komen in de dochterdelen terecht, pas als alles gerepliceerd is
kunnen de twee dochtercellen delen.
- Eukaryoten: eerst mitose en dan meiose.
- Prokaryoten: replicatiesnelheid is ongeveer 10x zo snel dan bij eukaryoten. Daardoor is de snelheid
van DNA-polymerase sneller dan die van RNA-polymerase (verhouding 10:1). Oplossing prokaryoten:
transcriptie vindt in dezelfde richting plaats als replicatie.
- Controle van genexpressie: wordt geregeld door promotor. Bij eukaryoten heeft ieder gen eigen
promotor. Bij prokaryoten: genen zijn georganiseerd in operons.
Bacteriële nucleoïd: hier vindt replicatie en expressie plaats. Nucleoïd = DNA met wat eiwitten. Genen die tot
expressie komen zitten in minder compacte gebieden. DNA zit gevouwen als supertwisting.
In eukaryoten zitten alle DNA in nucleosomen verpakt.
Lac-operon:
- Gebruik van lactose als suikerbron.
- 1 promotor waar transcriptiefactoren aan binden.
- Operator = waar repressor aan bindt.
- Gen zit vóór lac-operon à codeert voor repressor waardoor gen niet tot expressie komt bij voldoende
suiker (glucose). Geen glucose maar wel lactose à genexpressie door binding van allolactose aan
repressor. Er wordt dan 1 mRNA gemaakt waaruit 3 eiwitten worden gemaakt.
Plasmiden = extrachromosomaal DNA in bacteriën (behoren niet tot core chromosomen van de cel)
- Circulair, maar in sommige organismen lineair
- Bevatten meestal niet-essentiële genen (dus bacterie kan zonder plasmide leven), maar zitten nuttige
eigenschappen op om in andere omgevingen goed te kunnen groeien, bv.:
1
, o Resistentie tegen antibiotica van bijv. andere organismen in de bodem om andere
organismen weg te kunnen concurreren.
o Afbraak van bijv. tolueen
o Pathogeniciteit
o Symbiose
è Vergroot aanpassingsvermogen van bacteriën en doordat het makkelijk overdraagbaar is kan evolutie
worden bevorderd.
Eigenschappen van plasmiden:
- Replicatie van plasmiden gebeurt onafhankelijk van het chromosoom
o Eigen ORI waarin ook de eiwitten zitten die noodzakelijk zijn voor de initiatie van replicatie.
ORI bepaalt ook in hoeveel kopieën het plasmide aanwezig is. Als er een bepaalde
hoeveelheid van het plasmide aanwezig is dan accumuleert een repressor waardoor de
replicatie stopt.
- ORI vaak bepalend voor:
o Compatibiliteit: als een ander plasmide dezelfde ORI heeft dan zal er maar 1 van de 2
succesvol zijn, de ander gaat verloren.
o Host range
o Copy number
§ Single copy: replicatie lijkt op die van chromosoom en repliceert gelijktijdig met
chromosoom, 1 replicatie per celcyclus, gecontroleerde segregatie over
dochtercellen.
§ Multiple copy (kleinere plasmiden): meerdere replicaties per celcyclus, vaak een
karakteristiek aantal (bv 10-20/cel), segregatie verloopt random (niet gereguleerd).
Voorbeeld: ColE1 plasmide
- 2 RNA-moleculen
- ROP eiwit en RNAI reguleren RNAII functie à reguleren de initiatie van replicatie. Gaat als volgt:
o Stel er is weinig plasmide aanwezig, dan moet het gerepliceerd worden. Dan wordt RNAII
gevormd en die wordt geknipt in de buurt van de ORI. Dan heb je een kleine RNA primer die
wordt gebruikt door DNA-polymerase om een complementaire streng van het plasmide te
maken.
o Voldoende plasmide: veel RNAI productie = anti-sense RNA van RNAII
(complementair aan elkaar). Als die aan elkaar binden dan functioneert RNAII
niet meer goed. Remming door RNAI wordt versneld door ROP eiwit.
Plasmide partitionering:
- Passieve segregatie bij high copy plasmiden (of via killer/antidote). Killer/antidote
principe: selecteren op het behouden van het plasmiden. Killer/antidote ligt op
plasmide. Als plasmide aanwezig is maakt het een toxine en een antidote (= tegengif, om
zichzelf te beschermen).
- Stel dat bacterie riskeert om plasmide te verliezen: antistof is minder stabiel dan toxine
à toxine blijft over en bacterie sterft. Plasmide zorgt er dus voor dat het behouden blijft
à selectie op behoud van plasmide.
- Bij single copy plasmiden wordt segregatie geholpen door par genen (vergelijkbaar met
centromeer).
DNA coiling:
- Enzymen om supercoiling te krijgen. 1 manier om het te krijgen is door een enkelstrengs breuk te
maken. Hierdoor gaat er 1 streng los en deze gaat een aantal keren om de andere streng heen
wikkelen. Vervolgens worden de strengen weer geligeerd à supercoiling.
- Circulaire DNA gebruiken topoisomerase à dubbelstrengs breuk maken, om een andere streng heen
en daarna weer ligeren.
2
, DNA gelelektroforese:
- DNA is negatief geladen dus gaat naar de + pool
- Agarose vormt een netwerk (zeef effect) à kleine fragmenten gaan snel en grote langzaam
- Kleuring met ethidium bromide (EtBr) en vervolgens te zien door UV-belichting
o Gaat tussen de basenparen van het DNA zitten
o Kleurt vooral dubbelstrengs DNA goed
- Uitzetten in een grafiek: afstand die de band gemigreerd heeft tegen het molecuulgewicht
(grootte in bp), dan krijg je een niet-lineaire grafiek. Maar als je log10 neemt van de
fragmentgrootte krijg je een lineaire grafiek.
Mobiliteit van plasmide DNA:
- Topologie van DNA bepaalt de mobiliteit in de gel.
o Supercoiled is compact en klein en loopt dus snel door de gel heen
o Lineaire DNA zit tussen een nicked DNA in en supercoiled DNA
- EtBr beïnvloedt de topologie en dus de mobiliteit
Mechanismen van genetische uitwisseling:
- Conjugatie = overdracht van plasmide DNA tussen 2 bacteriën. Gaat via een conjugatiebuis (F-pili). F-
pili brengt de 2 bacteriën bij elkaar waarna ze DNA kunnen uitwisselen.
o Bijv. als het F-plasmide wordt overgedragen d.m.v. conjugatie dan wordt er een nik gemaakt
op de origin van de conjugatie = oriT. Hier start DNA-polymerase, maakt een nieuwe kopie en
die verplaatst de andere streng. De streng die dan vrijkomt wordt overgebracht via conjugatie
naar de andere cel.
o F-plasmide heeft een 33kb regio met ongeveer 40 genen, hierin ligt ook de oriT. TraA codeert
voor de pilin subeenheid.
§ Surface exclusion: als een bacterie al een eigen plasmide heeft, zal het niet binden
aan de pili à geen DNA overdracht.
o Het F-plasmide kan integreren in het genoom. Het wordt dan een episoom genoemd.
o Hele bacteriële genomen kunnen overgedragen worden door de geïntegreerde F-episoom.
o Sommige plasmiden zijn non-self transmissible
§ Ze hebben een oriT
§ Afhankelijk van andere plasmide voor de tra functie
o Belangrijke rol in bacteriële evolutie
- Transductie gaat d.m.v. een faag. Faag lambda heeft lineair DNA, maar als het in de bacterie komt
wordt het circulair en kan het gaan repliceren.
o Lysogene cyclus: infectie door faag: DNA wordt geïnjecteerd en wordt circulair. Faag DNA
integreert in het genoom en dan repliceert het gewoon mee met celdeling etc.
o Lytische cyclus: faag DNA integreert niet in het genoom, maar repliceert zelf. Er worden
nieuwe eiwitten gevormd voor nieuwe faagdeeltjes. Als de cel vol zit met faagdeeltjes is er
een actief proces waarmee de cel wordt gelyseerd à faag deeltjes komen vrij.
§ Soms verpakt faag ook stukje E. coli DNA. Als deze dan weer een andere bacterie
gaat infecteren, kan er door recombinatie een bepaalde eigenschap worden
uitgewisseld.
3
