Moleculaire technieken course 5 blok 2
Week 1
Waarom isoleren we de eiwitten niet direct uit de humane cellen? De concentratie is te laag.
Plasmide Eiwit tag Promotor Inducer Eiwit Antibiotica
van het fusie zuiverings resistentie
eiwit methode
pBAD/His A N-His araBAD Arabinose Affinity, Ni2+ Ampicilline
(bla gen)
pGEX-4T-1 N-GST tac IPTG Glutathione Ampicilline
(bla gen)
pET-15b N-His T7 IPTG Affinity, Ni2+ Ampicilline
(bla gen)
De tac-promotor is een synthetische promotor, het is een combinatie van de lac-promotor en
de tryptofaan promotor. Dit zorgt voor sterke expressie.
BL21(DE3)pLysS transformanten
De BL21 cellen hebben in het genoom het gen voor het eigen RNA polymerase. In het
genoom van de cellen is een DE3 cassette ingebouwd. In die cassette zit een T7 RNA
polymerase gen. Voor dat gen zit LacO (de lac operator). Hierdoor is de expressie van T7
RNA polymerase induceerbaar door allolactose of IPTG. De BL21 (DE3) cellen zijn lysogene
bacteriën. Dit houdt in dat het DE3 faag DNA in het genoom zit. Daardoor heeft de bacterie
het T7 RNA polymerase gen.
De pLysS plasmide in de BL21 cellen zorgt ervoor dat wanneer er geen inductie is, er ook
echt geen expressie is. Dus GEEN leaky expression. Het codeert voor het gen van T7
lysozym. Hierdoor wordt de T7 polymerase direct afgebroken en is er geen transcriptie van
het target gen. Bij inductie met allolactose/IPTG is er sprake van overexpressie van T7
polymerase. De pLyss plasmide maakt niet genoeg T7 lysozym aan om alles af te breken.
Er is dan dus WEL expressie van het target gen.
,De pBAD/His plasmide
AraC: regulatoire sequentie van de plasmide, het maakt deel uit van het ara-operon. Het
codeert voor het araC eiwit.
pBAD: promotor sequentie. Het AraC eiwit zal binden aan de promotor sequentie.
Afhankelijk van de bindingsplek zal transcriptie geactiveerd of repressed worden.
Arabinose inductie
In de praktijk zijn de structurele genen van het ara-operon uit de plasmide geknipt door
middel van restrictie enzymen, en is IDH1 op die plek geligeerd.
De absentie van arabinose zorgt ervoor dat het AraC eiwit de loop in het DNA veroorzaakt.
Hierdoor is er bijna geen expressie. Door het toevoegen van arabinose zal het binden aan
AraC. Hierdoor zal er geen loop vormen.
Leaky expression: de binding van het AraC eiwit aan O2 en I1 is niet 100% effectief.
Hierdoor zal er altijd een heel klein beetje expressie van de structurele genen. Hierdoor kan
de cel direct overschakelen naar het arabinose pathway in het geval van absentie van
glucose.
Het product van expressie in de pBAD/His plasmide is het fusie eiwit: 6x His - IDH1.
De pGEX-4T-1 plasmide
Regulatoire sequentie: LacI, codeert voor het repressor eiwit.
Tac-promotor: de promotor van de plasmide.
Tac-operator: hier bindt het repressor eiwit aan waardoor er geen transcriptie is.
Voor het induceren van de Tac-promotor wordt IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside)
gebruikt. Het is een molecuul dat op allolactose lijkt en ook op dezelfde manier aan het
repressor eiwit bindt. Het verschil is dat de cel IPTG niet kan afbreken. Allolactose kan de
cel heel makkelijk afbreken.
, Het fusie eiwit dat ontstaat door expressie in de pGEX-4T-1 plasmide: GST-IDH1.
Tussen de GST tag en IDH1 zit nog een thrombin site. Op die plek kan de GST tag door
proteases van het eiwit af geknipt worden.
Er is ook bij de pGEX-4T-1 plasmide sprake van leaky expression doordat het repressor
eiwit niet 100% effectief bij het binden aan de operator.
De pET-15b plasmide
De plasmide werkt samen met de BL21 cel en de pLyss plasmide zoals eerder beschreven.
Deze plasmide wordt ook geïnduceerd door middel van IPTG doordat het een Lac-operator
heeft. IPTG is dus nodig om aan het repressor eiwit te binden.
E. coli RNA polymerase zorgt voor de transcriptie van het LacI gen.
De pLyss plasmide
Eigenschap Staat voor Functie
CmR Chlooramfenicol resistentie Selectie factor. Door
gen chlooramfenicol toe toe
voegen aan het medium zal
de cel de pLyss plasmide
behouden.
p15A ori ORI voor de plasmide De plasmide kan zich
repliceren bij celdeling.
T7 lysozyme Gen voor T7 lysozym Het lysozym zorgt ervoor dat
de expressie van de genen
volledig controleerbaar is
met inductie.
GEEN MCS Deze plasmide is niet
geschikt voor klonering of
expressie.
Het fusie eiwit
Week 1
Waarom isoleren we de eiwitten niet direct uit de humane cellen? De concentratie is te laag.
Plasmide Eiwit tag Promotor Inducer Eiwit Antibiotica
van het fusie zuiverings resistentie
eiwit methode
pBAD/His A N-His araBAD Arabinose Affinity, Ni2+ Ampicilline
(bla gen)
pGEX-4T-1 N-GST tac IPTG Glutathione Ampicilline
(bla gen)
pET-15b N-His T7 IPTG Affinity, Ni2+ Ampicilline
(bla gen)
De tac-promotor is een synthetische promotor, het is een combinatie van de lac-promotor en
de tryptofaan promotor. Dit zorgt voor sterke expressie.
BL21(DE3)pLysS transformanten
De BL21 cellen hebben in het genoom het gen voor het eigen RNA polymerase. In het
genoom van de cellen is een DE3 cassette ingebouwd. In die cassette zit een T7 RNA
polymerase gen. Voor dat gen zit LacO (de lac operator). Hierdoor is de expressie van T7
RNA polymerase induceerbaar door allolactose of IPTG. De BL21 (DE3) cellen zijn lysogene
bacteriën. Dit houdt in dat het DE3 faag DNA in het genoom zit. Daardoor heeft de bacterie
het T7 RNA polymerase gen.
De pLysS plasmide in de BL21 cellen zorgt ervoor dat wanneer er geen inductie is, er ook
echt geen expressie is. Dus GEEN leaky expression. Het codeert voor het gen van T7
lysozym. Hierdoor wordt de T7 polymerase direct afgebroken en is er geen transcriptie van
het target gen. Bij inductie met allolactose/IPTG is er sprake van overexpressie van T7
polymerase. De pLyss plasmide maakt niet genoeg T7 lysozym aan om alles af te breken.
Er is dan dus WEL expressie van het target gen.
,De pBAD/His plasmide
AraC: regulatoire sequentie van de plasmide, het maakt deel uit van het ara-operon. Het
codeert voor het araC eiwit.
pBAD: promotor sequentie. Het AraC eiwit zal binden aan de promotor sequentie.
Afhankelijk van de bindingsplek zal transcriptie geactiveerd of repressed worden.
Arabinose inductie
In de praktijk zijn de structurele genen van het ara-operon uit de plasmide geknipt door
middel van restrictie enzymen, en is IDH1 op die plek geligeerd.
De absentie van arabinose zorgt ervoor dat het AraC eiwit de loop in het DNA veroorzaakt.
Hierdoor is er bijna geen expressie. Door het toevoegen van arabinose zal het binden aan
AraC. Hierdoor zal er geen loop vormen.
Leaky expression: de binding van het AraC eiwit aan O2 en I1 is niet 100% effectief.
Hierdoor zal er altijd een heel klein beetje expressie van de structurele genen. Hierdoor kan
de cel direct overschakelen naar het arabinose pathway in het geval van absentie van
glucose.
Het product van expressie in de pBAD/His plasmide is het fusie eiwit: 6x His - IDH1.
De pGEX-4T-1 plasmide
Regulatoire sequentie: LacI, codeert voor het repressor eiwit.
Tac-promotor: de promotor van de plasmide.
Tac-operator: hier bindt het repressor eiwit aan waardoor er geen transcriptie is.
Voor het induceren van de Tac-promotor wordt IPTG (isopropyl β-D-thiogalactoside)
gebruikt. Het is een molecuul dat op allolactose lijkt en ook op dezelfde manier aan het
repressor eiwit bindt. Het verschil is dat de cel IPTG niet kan afbreken. Allolactose kan de
cel heel makkelijk afbreken.
, Het fusie eiwit dat ontstaat door expressie in de pGEX-4T-1 plasmide: GST-IDH1.
Tussen de GST tag en IDH1 zit nog een thrombin site. Op die plek kan de GST tag door
proteases van het eiwit af geknipt worden.
Er is ook bij de pGEX-4T-1 plasmide sprake van leaky expression doordat het repressor
eiwit niet 100% effectief bij het binden aan de operator.
De pET-15b plasmide
De plasmide werkt samen met de BL21 cel en de pLyss plasmide zoals eerder beschreven.
Deze plasmide wordt ook geïnduceerd door middel van IPTG doordat het een Lac-operator
heeft. IPTG is dus nodig om aan het repressor eiwit te binden.
E. coli RNA polymerase zorgt voor de transcriptie van het LacI gen.
De pLyss plasmide
Eigenschap Staat voor Functie
CmR Chlooramfenicol resistentie Selectie factor. Door
gen chlooramfenicol toe toe
voegen aan het medium zal
de cel de pLyss plasmide
behouden.
p15A ori ORI voor de plasmide De plasmide kan zich
repliceren bij celdeling.
T7 lysozyme Gen voor T7 lysozym Het lysozym zorgt ervoor dat
de expressie van de genen
volledig controleerbaar is
met inductie.
GEEN MCS Deze plasmide is niet
geschikt voor klonering of
expressie.
Het fusie eiwit
