Praktijk course 5 blok 2
Inductie
Inductie is het opwekken van genexpressie door middel van een inducer molecule. Het
inducer molecuul is afhankelijk van het type promotor. Na de transformatie bevindt de
plasmide met het recombinant DNA zich in de BL21 (DE3) cellen. Het is belangrijk dat de
overnachtcultuur verdunt wordt tot een OD600 van 0.1. Vervolgens wordt deze cultuur
gegroeid in een stoof tot een OD600 tussen de 0.5 en 0.8. Op dat moment zijn de cellen in
de logfase. In de log-fase is de toename van cellen maximaal. Op dat moment kan het
inducer molecuul worden toegevoegd. Vervolgens worden de samples geïncubeerd.
Tenslotte worden alle samples gecentrifugeerd. Hierdoor zullen alle celresten neerslaan. De
eiwitten bevinden zich in het supernatant.
Bij de inductie wordt gebruik gemaakt van twee soorten antibiotica
- Chlooramfenicol: de pLyss plasmide bevat het resistentie gen voor dit antibioticum
waardoor de cel de plasmide behoudt.
- Carabenicilline: stabieler dan ampicilline.
Inductie van de pBAD plasmide
De pBAD/His plasmide wordt geïnduceerd door arabinose. De plasmide heeft een pBAD
promotor. RNA polymerase kan in de afwezigheid van arabinose niet de structurele genen
(of in de praktijk IDH1) transcriberen doordat het DNA zich in een loop bevindt. Deze loop
wordt veroorzaakt doordat het gen AraC codeert voor het AraC eiwit en wordt altijd
getranscribeerd doordat het voor de pBAD promotor zit. Er is dus altijd repressie tenzij er
inductie is. Het AraC eiwit bindt zich aan twee plekken van het DNA waardoor er een lus
ontstaat. Bij inductie zal arabinose aan het AraC eiwit binden en kan RNA polymerase het
transcript aflezen.
Inductie van de pGEX-4T1 plasmide
De pGEX-4T-1 plasmide heeft een tac-promotor. Deze synthetische promotor maakt gebruik
van de promotor en operator van het Lac-operon. Ten alle tijden wordt het LacI gen tot
expressie gebracht. Dit gen codeert voor het repressor eiwit. Dit bindt aan de operator.
Hierdoor kan RNA polymerase niet binden en is er geen transcriptie. Het inducer molecuul is
IPTG. Dit lijkt op allolactose en werkt op dezelfde manier. Het verschil is dat IPTG niet direct
door de cel afgebroken wordt. IPTG bindt aan het repressor eiwit. Hierdoor kan RNA
polymerase binden aan de promotor.
Inductie van de pET-15b plasmide
De pET-15b plasmide heeft een ander mechanisme. De plasmide heeft een T7 promotor.
Het RNA polymerase van E. coli kan hier niet aan binden. Het gen voor T7 polymerase
bevindt zich in een cassette (DE3) in het genomische DNA van de BL21 cellen. RNA
polymerase zal dit afschrijven, maar doordat de BL21 cellen nog een plasmide bevat wordt
het direct afgebroken. Er is zonder inductie GEEN leaky expression. Deze plasmide heet
pLyss en bevat het gen voor T7 lysozym. Het inducer molecuul is IPTG. Door het toevoegen
van IPTG wordt T7 polymerase in overexpressie gebracht. Er is daardoor genoeg T7
, polymerase over dat niet wordt afgebroken. De pLyss plasmide bevat dus het gen voor T7
lysozym, waardoor er bij afwezigheid van een inducer molecuul GEEN expressie is.
De rol van cAMP bij inductie
cyclisch AMP wordt alleen door de cel geproduceerd als er geen glucose aanwezig is. cAMP
zal binden aan de CAP-site. De CAP-site bevindt zich upstream van de promotor. Als cAMP
aan de CAP-site bindt wordt de binding van RNA polymerase aan de promotor versterkt.
Hierdoor is er een hoog niveau van transcriptie. Als er ook glucose in het medium aanwezig
is, zal de cel weinig tot geen cAMP maken. Hierdoor kan RNA polymerase niet goed aan de
promotor binden. Er is wel expressie, maar op een laag niveau.
Resultaten en controles
De resultaten van inductie zijn pas zichtbaar bij eiwit isolatie.
Troubleshooting
Geen expressie
- De verkeerde inducer is gebruikt.
- Onjuiste groei omstandigheden
Cellen zijn dood
- Het eiwit is toxisch voor de cel
Eiwit isolatie
Het fusie eiwit is na de inductie tot overexpressie gebracht. Om het verder te kunnen
onderzoeken moet het eiwit geïsoleerd worden. In de praktijk worden hier twee methodes
voor gecombineerd.
Lysis door lysozymen
Lysozymen zijn enzymen die de bindingen in de peptidoglycaanlaag van de celwand
verbreken. Hierdoor ontstaan er gaten in de celwand. Door het verschil in osmotische
waarde zal de cel uiteen klappen. Na een half uur incuberen op ijs moet er PMSF aan het
sample worden toegevoegd. PMSF zorgt ervoor dat de eiwitten niet afgebroken worden door
de proteases die vrij zijn gekomen uit de cel.
Ultrasonificatie
Doordat lysis door middel van lysozymen niet 100% effectief is wordt de methode
gecombineerd met ultrasonificatie. Deze isolatie methode werkt doordat er ultrasonische
2
Inductie
Inductie is het opwekken van genexpressie door middel van een inducer molecule. Het
inducer molecuul is afhankelijk van het type promotor. Na de transformatie bevindt de
plasmide met het recombinant DNA zich in de BL21 (DE3) cellen. Het is belangrijk dat de
overnachtcultuur verdunt wordt tot een OD600 van 0.1. Vervolgens wordt deze cultuur
gegroeid in een stoof tot een OD600 tussen de 0.5 en 0.8. Op dat moment zijn de cellen in
de logfase. In de log-fase is de toename van cellen maximaal. Op dat moment kan het
inducer molecuul worden toegevoegd. Vervolgens worden de samples geïncubeerd.
Tenslotte worden alle samples gecentrifugeerd. Hierdoor zullen alle celresten neerslaan. De
eiwitten bevinden zich in het supernatant.
Bij de inductie wordt gebruik gemaakt van twee soorten antibiotica
- Chlooramfenicol: de pLyss plasmide bevat het resistentie gen voor dit antibioticum
waardoor de cel de plasmide behoudt.
- Carabenicilline: stabieler dan ampicilline.
Inductie van de pBAD plasmide
De pBAD/His plasmide wordt geïnduceerd door arabinose. De plasmide heeft een pBAD
promotor. RNA polymerase kan in de afwezigheid van arabinose niet de structurele genen
(of in de praktijk IDH1) transcriberen doordat het DNA zich in een loop bevindt. Deze loop
wordt veroorzaakt doordat het gen AraC codeert voor het AraC eiwit en wordt altijd
getranscribeerd doordat het voor de pBAD promotor zit. Er is dus altijd repressie tenzij er
inductie is. Het AraC eiwit bindt zich aan twee plekken van het DNA waardoor er een lus
ontstaat. Bij inductie zal arabinose aan het AraC eiwit binden en kan RNA polymerase het
transcript aflezen.
Inductie van de pGEX-4T1 plasmide
De pGEX-4T-1 plasmide heeft een tac-promotor. Deze synthetische promotor maakt gebruik
van de promotor en operator van het Lac-operon. Ten alle tijden wordt het LacI gen tot
expressie gebracht. Dit gen codeert voor het repressor eiwit. Dit bindt aan de operator.
Hierdoor kan RNA polymerase niet binden en is er geen transcriptie. Het inducer molecuul is
IPTG. Dit lijkt op allolactose en werkt op dezelfde manier. Het verschil is dat IPTG niet direct
door de cel afgebroken wordt. IPTG bindt aan het repressor eiwit. Hierdoor kan RNA
polymerase binden aan de promotor.
Inductie van de pET-15b plasmide
De pET-15b plasmide heeft een ander mechanisme. De plasmide heeft een T7 promotor.
Het RNA polymerase van E. coli kan hier niet aan binden. Het gen voor T7 polymerase
bevindt zich in een cassette (DE3) in het genomische DNA van de BL21 cellen. RNA
polymerase zal dit afschrijven, maar doordat de BL21 cellen nog een plasmide bevat wordt
het direct afgebroken. Er is zonder inductie GEEN leaky expression. Deze plasmide heet
pLyss en bevat het gen voor T7 lysozym. Het inducer molecuul is IPTG. Door het toevoegen
van IPTG wordt T7 polymerase in overexpressie gebracht. Er is daardoor genoeg T7
, polymerase over dat niet wordt afgebroken. De pLyss plasmide bevat dus het gen voor T7
lysozym, waardoor er bij afwezigheid van een inducer molecuul GEEN expressie is.
De rol van cAMP bij inductie
cyclisch AMP wordt alleen door de cel geproduceerd als er geen glucose aanwezig is. cAMP
zal binden aan de CAP-site. De CAP-site bevindt zich upstream van de promotor. Als cAMP
aan de CAP-site bindt wordt de binding van RNA polymerase aan de promotor versterkt.
Hierdoor is er een hoog niveau van transcriptie. Als er ook glucose in het medium aanwezig
is, zal de cel weinig tot geen cAMP maken. Hierdoor kan RNA polymerase niet goed aan de
promotor binden. Er is wel expressie, maar op een laag niveau.
Resultaten en controles
De resultaten van inductie zijn pas zichtbaar bij eiwit isolatie.
Troubleshooting
Geen expressie
- De verkeerde inducer is gebruikt.
- Onjuiste groei omstandigheden
Cellen zijn dood
- Het eiwit is toxisch voor de cel
Eiwit isolatie
Het fusie eiwit is na de inductie tot overexpressie gebracht. Om het verder te kunnen
onderzoeken moet het eiwit geïsoleerd worden. In de praktijk worden hier twee methodes
voor gecombineerd.
Lysis door lysozymen
Lysozymen zijn enzymen die de bindingen in de peptidoglycaanlaag van de celwand
verbreken. Hierdoor ontstaan er gaten in de celwand. Door het verschil in osmotische
waarde zal de cel uiteen klappen. Na een half uur incuberen op ijs moet er PMSF aan het
sample worden toegevoegd. PMSF zorgt ervoor dat de eiwitten niet afgebroken worden door
de proteases die vrij zijn gekomen uit de cel.
Ultrasonificatie
Doordat lysis door middel van lysozymen niet 100% effectief is wordt de methode
gecombineerd met ultrasonificatie. Deze isolatie methode werkt doordat er ultrasonische
2
