Plasmide isolatie
Plasmiden kunnen worden gebruikt om een stukje vreemd DNA in te bouwen in een
organisme. Je kan hier ook een promotor in zetten, hierdoor kan je controleren wanneer je
operon aan en uit straat. Daarnaast heb je heel veel plasmide, het repliceert zichzelf. Zo heb
je dus heel snel heel geel gen dat je wil onderzoeken. Het isoleren van plasmide DNA gaat
via de volgende stappen:
1. Resuspenderen → RNAse breekt al het RNA in de cel af
a. Tris-HCL, glucose, EDTA, RNAse
i. Tris-HCl → buffer, zorgt voor de juist pH
ii. Glucose → zorgt voor een isotone oplossing
iii. EDTA → bindt Mg+ ionen zodat enzymen zoals DNAse niet werken
iv. RNAse → afbreken van RNA in de cel
2. Lyseren → het plasmide DNA vrijmaken van het chromosomale DNA
a. NaOH en SDS
i. NaOH → zorgt voor een hoge pH waardoor de cellen kapot
gaan
ii. SDS → verbreken van S-S bruggen, chromosomaal DNA wordt
selectief gedenatureerd
3. Neutraliseren → het kwijtraken van de hoge pH waardoor een snotje
ontstaat.
a. Azijnzuur
i. HAc
ii. KAc → zorgt voor het neerslaan van alles behalve het
plasmide
→ het plasmide DNA is nu gerenatureerd en opgelost in de oplossing, door te
centrifugeren komen alle overige celonderdelen in de pellet. Je gaat dus verder
met het supernatant.
4. Verlagen oplosbaarheid van het plasmide → door vervolgens te
centrifugeren ontstaat er een pellet van plasmide.
a. Isopropanol → verlaagt de oplosbaarheid van het plasmide DNA
5. Elutie → het verwijderen van de laatste restjes isopropanol en de zouten in
het pellet.
a. 70% ethanol → het verwijderen van de laatste restjes isopropanol
en de zouten in het plasmide DNA
Belangrijke onderdelen in een pUC:
- Ampr → ampicilline resistentie, kan worden gebruikt om bacteriën met
bepaalde plasmiden te isoleren
- MCS (multiple cloning site) → een plaats met veel restrictieplaatsen die
maar op een enkele plek in het plasmide kunnen knippen, het zijn single
cutters
, - Hierop ligt het lacZ gen, wanneer deze intact is er geen
insert aanwezig en kan er lactose afgebroken worden
- Ori (origin of replication) → een plek in het genoom waar
de replicatie van DNA of RNA begint
Om een stukje DNA in een plasmide te krijgen moet je zowel het DNA als
het plasmide knippen met dezelfde restrictie-enzymen (enzymen die
worden gebruikt om DNA fragmenten op specifieke plaatsen te knippen).
Zo ontstaan er dezelfde sticky end en kan het stukje DNA in het plasmide
terecht komen. Om te voorkomen dat het plasmide weer aan zichzelf gaat
binden kan er gebruikt worden gemaakt van twee restrictie-enzymen. Zo
kan je ook de oriëntatie van het stukje DNA in het plasmide bepalen.
Hierna moet de plasmide ook nog in de (E. coli) cel worden geplaatst. Dit gebeurt
met behulp van een CaCl oplossing. Door deze oplossing wordt de celwand
gedestabiliseerd en door de cellen vervolgens een beetje te verwarmen (42
graden → heat shock) gaat de celwand een beetje open en kan het
gemodificeerde plasmide de cel in.
PCR → Polymerase Chain Reaction
→ repeterende serie van cycli die bestaat uit drie stappen
Een plasmide is circulair dsDNA, deze bevatten een polylinker. Een polylinker is een plek
met een reeks unieke restrictieplaatsen (enzymen) die nergens anders in het plasmide te
vinden zijn. Het plasmide kan op een enkele plek worden opengeknipt en hier kan een stukje
DNA worden ‘ingevoegd’, een insert (= region of interest, ROI).
1. Denaturatie stap, 94°C
a. Door de hoge temperaturen worden de DNA strengen
enkelstrengs
2. Annealing stap, 50-60°C
a. Binden van primer aan het complementaire stukje DNA
van de plasmide
b. De temperatuur is afhankelijk van de gebruikte primers
en de zoutconcentratie (5°C onder de melting
temperatuur, dan zijn alle primers ge-annealed)
c. Verkeerde temperatuur → primer bindt aan de verkeerde plek
d. Door de overmaat van primers zullen de DNA-strengen niet re-annealen
3. Elongatie stap, 72°C (verlengen)
a. Taq polymerase verlengt de primer en maakt complete kopieën van het
template DNA
b. De optimum temperatuur van Taq polymerase is 72°C
Deze cyclus wordt ongeveer 30 (tot 40) keer uitgevoerd voor 230 kopieën.
Benodigdheden voor PCR
- Template DNA → sjabloon voor taq polymerase
- Taq-polymerase → verlengen van DNA strengen door het aanplakken van
nucleotiden
Plasmiden kunnen worden gebruikt om een stukje vreemd DNA in te bouwen in een
organisme. Je kan hier ook een promotor in zetten, hierdoor kan je controleren wanneer je
operon aan en uit straat. Daarnaast heb je heel veel plasmide, het repliceert zichzelf. Zo heb
je dus heel snel heel geel gen dat je wil onderzoeken. Het isoleren van plasmide DNA gaat
via de volgende stappen:
1. Resuspenderen → RNAse breekt al het RNA in de cel af
a. Tris-HCL, glucose, EDTA, RNAse
i. Tris-HCl → buffer, zorgt voor de juist pH
ii. Glucose → zorgt voor een isotone oplossing
iii. EDTA → bindt Mg+ ionen zodat enzymen zoals DNAse niet werken
iv. RNAse → afbreken van RNA in de cel
2. Lyseren → het plasmide DNA vrijmaken van het chromosomale DNA
a. NaOH en SDS
i. NaOH → zorgt voor een hoge pH waardoor de cellen kapot
gaan
ii. SDS → verbreken van S-S bruggen, chromosomaal DNA wordt
selectief gedenatureerd
3. Neutraliseren → het kwijtraken van de hoge pH waardoor een snotje
ontstaat.
a. Azijnzuur
i. HAc
ii. KAc → zorgt voor het neerslaan van alles behalve het
plasmide
→ het plasmide DNA is nu gerenatureerd en opgelost in de oplossing, door te
centrifugeren komen alle overige celonderdelen in de pellet. Je gaat dus verder
met het supernatant.
4. Verlagen oplosbaarheid van het plasmide → door vervolgens te
centrifugeren ontstaat er een pellet van plasmide.
a. Isopropanol → verlaagt de oplosbaarheid van het plasmide DNA
5. Elutie → het verwijderen van de laatste restjes isopropanol en de zouten in
het pellet.
a. 70% ethanol → het verwijderen van de laatste restjes isopropanol
en de zouten in het plasmide DNA
Belangrijke onderdelen in een pUC:
- Ampr → ampicilline resistentie, kan worden gebruikt om bacteriën met
bepaalde plasmiden te isoleren
- MCS (multiple cloning site) → een plaats met veel restrictieplaatsen die
maar op een enkele plek in het plasmide kunnen knippen, het zijn single
cutters
, - Hierop ligt het lacZ gen, wanneer deze intact is er geen
insert aanwezig en kan er lactose afgebroken worden
- Ori (origin of replication) → een plek in het genoom waar
de replicatie van DNA of RNA begint
Om een stukje DNA in een plasmide te krijgen moet je zowel het DNA als
het plasmide knippen met dezelfde restrictie-enzymen (enzymen die
worden gebruikt om DNA fragmenten op specifieke plaatsen te knippen).
Zo ontstaan er dezelfde sticky end en kan het stukje DNA in het plasmide
terecht komen. Om te voorkomen dat het plasmide weer aan zichzelf gaat
binden kan er gebruikt worden gemaakt van twee restrictie-enzymen. Zo
kan je ook de oriëntatie van het stukje DNA in het plasmide bepalen.
Hierna moet de plasmide ook nog in de (E. coli) cel worden geplaatst. Dit gebeurt
met behulp van een CaCl oplossing. Door deze oplossing wordt de celwand
gedestabiliseerd en door de cellen vervolgens een beetje te verwarmen (42
graden → heat shock) gaat de celwand een beetje open en kan het
gemodificeerde plasmide de cel in.
PCR → Polymerase Chain Reaction
→ repeterende serie van cycli die bestaat uit drie stappen
Een plasmide is circulair dsDNA, deze bevatten een polylinker. Een polylinker is een plek
met een reeks unieke restrictieplaatsen (enzymen) die nergens anders in het plasmide te
vinden zijn. Het plasmide kan op een enkele plek worden opengeknipt en hier kan een stukje
DNA worden ‘ingevoegd’, een insert (= region of interest, ROI).
1. Denaturatie stap, 94°C
a. Door de hoge temperaturen worden de DNA strengen
enkelstrengs
2. Annealing stap, 50-60°C
a. Binden van primer aan het complementaire stukje DNA
van de plasmide
b. De temperatuur is afhankelijk van de gebruikte primers
en de zoutconcentratie (5°C onder de melting
temperatuur, dan zijn alle primers ge-annealed)
c. Verkeerde temperatuur → primer bindt aan de verkeerde plek
d. Door de overmaat van primers zullen de DNA-strengen niet re-annealen
3. Elongatie stap, 72°C (verlengen)
a. Taq polymerase verlengt de primer en maakt complete kopieën van het
template DNA
b. De optimum temperatuur van Taq polymerase is 72°C
Deze cyclus wordt ongeveer 30 (tot 40) keer uitgevoerd voor 230 kopieën.
Benodigdheden voor PCR
- Template DNA → sjabloon voor taq polymerase
- Taq-polymerase → verlengen van DNA strengen door het aanplakken van
nucleotiden
